31124.皺紋盤(pán)鮑內(nèi)臟纖維素酶的分離純化與分子克隆

1、橐萎大學(xué)碩士學(xué)位論文皺紋盤(pán)鮑內(nèi)臟纖維素酶的分離純化與分子克隆Purification，characterizationandcloningofacellUlase雨Rnabalone(Haliotisdiscushanna力V—SCera論文答辯日期：壟Q里壘生魚(yú)旦旦皺紋盤(pán)鮑內(nèi)臟纖維素酶的分離純化與分子克隆摘要鮑魚(yú)內(nèi)臟的消化器官中含有豐富的多糖、蛋白水解酶類(lèi)。其中纖維素酶是一類(lèi)能夠降解纖維素轉(zhuǎn)變成纖維寡糖和葡萄糖的多糖酶系。目前我國(guó)鮑魚(yú)

2、加工過(guò)程中，占體重25—30％的內(nèi)臟往往被丟棄或簡(jiǎn)單加工成動(dòng)物飼料等，不僅造成資源浪費(fèi)，而且給環(huán)境也帶來(lái)了污染。因此，鮑魚(yú)內(nèi)臟的高效利用受到越來(lái)越多的關(guān)注。本研究以鮑魚(yú)為研究對(duì)象，從鮑魚(yú)內(nèi)臟中高度純化纖維素酶，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)研究。進(jìn)一步利用純化的纖維素酶對(duì)藻類(lèi)進(jìn)行定向酶解，制備具有功能活性的寡糖。與此同時(shí)，利用分子生物學(xué)手段，對(duì)編碼纖維素酶的基因進(jìn)行克隆，獲得纖維素酶基因全序列，對(duì)纖維素酶空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，分析纖維素酶的活性區(qū)域以

3、及底物結(jié)合區(qū)域等。本研究不僅為鮑魚(yú)內(nèi)臟綜合利用提供了新思路，也豐富了鮑魚(yú)纖維素酶研究的基礎(chǔ)理論。本研究通過(guò)一系列生化分離手段從鮑魚(yú)內(nèi)臟中分離純化出一種纖維素酶。SDSPAGE以及NativePAGE均顯示出單一條帶，其分子量約為45kDa。肽質(zhì)量指紋圖譜獲得12個(gè)肽段，含103個(gè)氨基酸殘基，與來(lái)自于盤(pán)鮑(Haliotisdiscusdiscus)和盤(pán)螺鮑(Haliotisdiscus)的纖維素酶序列一致性為100％，證明純化的蛋白為一種

4、纖維素酶。該酶的最適溫度為45oC，對(duì)熱較穩(wěn)定。該酶的最適pH為55，對(duì)酸堿均不穩(wěn)定。金屬離子對(duì)纖維素酶活性影響很大，Mn2，M92，Ba2，Ca2能夠顯著地促進(jìn)酶的活性，而Cu2，Zn2，F(xiàn)e2，Sn：對(duì)其活性產(chǎn)生抑制。底物特異性表明該纖維素酶屬于一種內(nèi)切D1，4葡糖苷酶。運(yùn)用純化的纖維素酶對(duì)紫菜進(jìn)行酶解，制備的紫菜寡糖具有較好的抗氧化能力，包括對(duì)羥基自由基的清除、DPPH自由基的清除、亞鐵離子的螯合能力以及還原力等。清除DPPH自由

5、基和羥自由基的EC50分別為689mg／mL和651mg／mL，對(duì)亞鐵離子螯合的ECso為524mg／mL。根據(jù)肽質(zhì)量指紋圖譜獲得的纖維素酶部分序列以及纖維素酶的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)引物，克隆得到纖維素酶的全序列。序列全長(zhǎng)1896bp，在GenBank登錄號(hào)為KC4561601。編碼區(qū)的1785bp位于核苷酸序列的561840位，N端的14個(gè)氨基酸被認(rèn)為是信號(hào)肽區(qū)域。本次純化得到的纖維素酶經(jīng)過(guò)肽質(zhì)量指紋圖譜分析獲得的氨基酸序列并不含有N端的1

6、／4區(qū)域序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，該纖維素酶與來(lái)自于海洋動(dòng)物的纖維素酶同源性較高，與來(lái)自于微生物、植物的纖維素酶同源性較低，證明該纖維素酶直接來(lái)自于鮑魚(yú)本身，而不是其消化系統(tǒng)中的微生物等。本文以鮑魚(yú)為研究對(duì)象，從內(nèi)臟中分離純化出一種纖維素酶，對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)研究。運(yùn)用分子生物學(xué)手段，克隆得到編碼纖維素酶的全序列。本研究為鮑魚(yú)內(nèi)臟資源的綜合利用提供了理論參考，同時(shí)豐富了纖維素酶基礎(chǔ)理論方面的研究。關(guān)鍵詞鮑魚(yú)，纖維素酶，分離純化，性質(zhì)分