球孢白僵菌中疏水蛋白基因功能的研究.pdf

1、真菌和昆蟲的相互作用在維持生態(tài)系統(tǒng)平衡,保持生物多樣性和在病原菌的進化方面起重要作用。昆蟲病原真菌是自然界控制有害昆蟲群體數(shù)量的主要因素之一,由真菌致病死亡的昆蟲約占全部病原微生物致病死亡的60％。昆蟲病原真菌是自然界中唯一能直接穿透寄主體壁致病的病原微生物,其致病機制比病原細菌、病毒更為復(fù)雜。昆蟲病原真菌.球孢白僵菌(Beauveria bassiana),既可以腐生和作為植物內(nèi)生菌的形式生活,也可以感染和寄生昆蟲和其他節(jié)肢動物。雖然

2、白僵菌(B.bassiana)可以根據(jù)不同的外界環(huán)境產(chǎn)生不同形態(tài)的孢子,例如分生孢子、芽生孢子、微循環(huán)孢子以及在昆蟲體內(nèi)產(chǎn)生蟲菌體,但是它主要靠分生孢子侵染寄主昆蟲。分生孢子成功吸附到昆蟲表皮是致病過程中第一步也是非常關(guān)鍵的過程。在昆蟲病原真菌金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)中已經(jīng)克隆了兩個跟真菌附著相關(guān)的基因,一個在孢子與昆蟲之間的附著密切相關(guān),另外一個在孢子與植物之間的附著發(fā)揮重要的作用,但是在白僵菌(B

3、.bassiana)中沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)的蛋白。
　　 疏水蛋白是一類在真菌中分布廣泛,功能多樣的蛋白,在包括致病等許多重要的過程中發(fā)揮著重要的作用。盡管有些學者認為由疏水蛋白介導的疏水性作用力在介導真菌和昆蟲之間的吸附中起重要作用,但是目前仍然缺少直接的證據(jù)。本論文以國內(nèi)外應(yīng)用廣泛的球孢白僵菌(B.bassiana)為研究材料,在獲得兩個疏水蛋白基因的基礎(chǔ)上應(yīng)用基因敲除技術(shù)結(jié)合掃描電鏡、原子力顯微鏡和免疫熒光技術(shù)分析其在真菌生長、發(fā)

4、育和致病機理中的功能。
　　 主要研究成果如下:
　　 ①球孢白僵菌(B.bassiana)高效穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化標記的篩選成功的將稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)磺酰脲(sulfonylurea)的抗性基因sur(acetolactate synthase gene)轉(zhuǎn)入到球孢白僵菌(B.bassiana)中。轉(zhuǎn)化效率達到了100-150轉(zhuǎn)化子/μg DNA。以sur基因為篩選標記,構(gòu)建了pSUR-eGFP載

5、體,該載體含有egfp的表達原件,得到的重組菌株既具有磺酰脲的抗性,又能觀察到較強的熒光,并且轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定。
　　 ②轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化通過調(diào)節(jié)選擇培養(yǎng)基的pH達到了提高轉(zhuǎn)化效率的目的。以pSUR-eGFP為載體,轉(zhuǎn)化效率由未調(diào)節(jié)之前的40個轉(zhuǎn)化子/μg DNA(pH7.5)達到了調(diào)節(jié)后的150個轉(zhuǎn)化子/μg DNA(pH6.5)。改進后的轉(zhuǎn)化效率顯著高于球孢白僵菌(B.bassiana)的其它轉(zhuǎn)化方法(5-50個轉(zhuǎn)化子/μg

6、DNA)。另外,感受態(tài)細胞制備以后,至少可以穩(wěn)定保存3個月不影響轉(zhuǎn)化效率,接下來的轉(zhuǎn)化步驟與酵母的轉(zhuǎn)化很相似,只需1 h就可以完成,大大簡便了球孢白僵菌(B.bassiana)的遺傳轉(zhuǎn)化。
　　 ③hyd1和hyd2側(cè)翼序列的克隆利用YADE(Y shape adaptor dependent extension)技術(shù),根據(jù)已知的序列設(shè)計引物,分別對hyd1和hyd2的上、下游序列進行延伸,得到包括啟動子序列和完整的開放閱讀框的

7、片段4.3 kb(hyd1)和2.9 kb(hyd2),GenBank登錄號分別為EF452344和EF520285。
　　 ④疏水蛋白基因功能研究a.蛋白定位免疫熒光分析表明,Hyd1分布在分生孢子和微循環(huán)孢子的表面,在芽生孢子中沒有檢測到表達。在萌發(fā)的孢子中,只在孢子基座中檢測到nyd1,在新萌發(fā)的芽管中沒有檢測到表達。與Hyd1相比,Hyd2的信號比較弱,只分布在分生孢子表面,在微循環(huán)孢子和芽生孢子中沒有檢測到表達。與Hy

8、d1相似,Hyd2在萌發(fā)的孢子中只分布在孢子基座中,在芽管中沒有檢測到表達。另外,在蟲菌體中沒有檢測到Hyd1和Hyd2。
　　 b.疏水蛋白在形成孢子外壁中的模型根據(jù)掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)和原子力顯微鏡(atomicforce electron microscope.AFM)對孢子表面的觀察結(jié)果,比較了野生型菌株和各突變體孢子表面特征的差異,得到nyd1和Hyd2在球孢白僵

9、菌(B.bassiana)孢子外壁形成中的模型。Hyd1負責形成孢子表面的“突起”(fascicle bundles),同時它起到“邊界蛋白”/“伴侶蛋白”的功能,使Hyd2形成有序的結(jié)構(gòu)。Hyd2形成“突起”(fascicle bundles)上的“條紋狀”(Rodlets)的結(jié)構(gòu)。二者有序的排列在一起共同組成分生孢子表面結(jié)構(gòu)。
　　 c.疏水蛋白在球孢白僵菌(B.bassiana)發(fā)育中的作用孢子疏水性測試(microbia

10、l adhesion to hydrocarbons,MATH)表明,hyd1和hyd2都賦予分生孢子疏水性,hyd1和hyd2同時缺失將會使孢子的疏水性進一步下降。△hvd1的孢子在溶液中很難分散,容易形成塊狀結(jié)構(gòu),△hyd2的孢子對疏水性底物的吸附能力大大降低。hyd1和hyd2的缺失不會影響球孢白僵菌(B.bassiana)在PDA和SDB培養(yǎng)基上的萌發(fā),不會影響菌株對KC1、calcofluor white、山梨醇、SDS和干果

11、紅等的抗逆性。
　　 d.疏水蛋白缺失影響細胞壁碳水化合物的種類和分布生物凝集素和β-1,3葡聚糖抗體標記顯示相比野生型菌株,△hyd1和△hyd1△hyd2對所測試的凝集素和β-1,3葡聚糖抗體的結(jié)合能力提高了2-4倍,△hyd2的結(jié)合能力與野生型菌株差異不顯著。
　　 e.疏水蛋白的缺失影響球孢白僵菌(B.bassiana)的毒力毒力測試表明,體壁侵染時相比野生型菌株,疏水蛋白突變菌株對大蠟螟(Galleria me