轉(zhuǎn)植酸酶基因小球藻的培養(yǎng)及其生理生化分析.pdf

1、本研究在已經(jīng)驗(yàn)證成功地將植酸酶基因轉(zhuǎn)入海水小球藻并檢測到植酸酶表達(dá)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行植酸酶表達(dá)穩(wěn)定性分析，對轉(zhuǎn)基因小球藻進(jìn)行生理生化分析，考察培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基組成對轉(zhuǎn)基因小球藻的生長及植酸酶酶活的影響，得出優(yōu)化組合，為今后大規(guī)模高密度培養(yǎng)打下基礎(chǔ)，對于深入開發(fā)微藻資源及植酸酶的應(yīng)用具有深遠(yuǎn)的意義。 通過三種方法對轉(zhuǎn)基因小球藻進(jìn)行破碎，比較蛋白和植酸酶酶活的測量數(shù)值，得出超聲波破碎法對細(xì)胞壁的破碎更完全，能獲得更高的測量值。確定使用超

2、聲波破碎法破壁的最佳時(shí)間為8min。 從G418抗性平板上挑42個(gè)轉(zhuǎn)植酸酶基因小球藻單克隆藻株，培養(yǎng)到一定量，通過植酸酶活性比較，篩選出植酸酶酶活較高的8株藻，經(jīng)過7次傳代，植酸酶活并無衰減趨勢，證實(shí)植酸酶基因在小球藻中穩(wěn)定表達(dá)。對轉(zhuǎn)基因小球藻產(chǎn)生的植酸酶進(jìn)行酶性質(zhì)研究，此酶最適作用pH值為pH3.8和pH6.0，最適作用溫度為65℃，耐熱能力較好，有利于飼料加工過程酶活的保持。在相同培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因藻與未轉(zhuǎn)基因藻生理指標(biāo)并無

3、明顯差異，說明外源植酸酶基因的轉(zhuǎn)入對小球藻的生長及生理指標(biāo)無明顯影響。 考察接種量、溫度、pH、光強(qiáng)對小球藻生長與植酸酶酶活的影響。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果：接種量濃度取0.074～0.126mg/ml之間，溫度22.5℃，pH值8～10，光強(qiáng)范圍：1000～5000lx。做溫度、pH、光強(qiáng)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)得出：獲得轉(zhuǎn)基因小球藻最大密度的優(yōu)化組合為：22.5℃，pH值9.5，光強(qiáng)4500±100lx；獲得最大植酸酶活的優(yōu)化組合為：溫

4、度25℃，pH值8，光強(qiáng)1000±100lx，并通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)。 考察碳源、氮源、磷源、維生素對轉(zhuǎn)基因小球藻的生長及植酸酶酶活的影響。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果：0.2g/LNaHCO3；0.5g/LNH4NO3；0.02g/LKH2PO4(獲得最大比生長速率μmax)，0.08g/LKH2PO4(獲得最大檀酸酶比活值P.Amax)；0.3mg/LVB1(μmax)，0.6mg/LVB1(P.Amax)；4μg/LVB12(μmax)

5、，1μg/LVB12(P.Amax)。對NaHCO3，NH4NO3，KH2PO4，VB1與VB12做五因素四水平的正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，獲得轉(zhuǎn)基因小球藻最大密度的優(yōu)化組合為：A4B1C1D1E1，即：NaHCO30.4g/L，NH4NO30.25g/L，KH2PO40.02g/L，VB10.15mg/L與VB120.5μg/L。獲得轉(zhuǎn)基因小球藻最大植酸酶比活值的優(yōu)化組合為：A3B2C3D3E2，即：NaHCO30.3g/L，NH4NO30