小球藻親環(huán)蛋白A(CyPA)基因克隆與功能研究.pdf

1、親環(huán)蛋白A是結(jié)構(gòu)保守的，具有肽酰脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(PPIase)活性的一類(lèi)蛋白，可以催化肽鏈中Xaa-Pro肽鍵的順?lè)凑郫B，促進(jìn)體內(nèi)以脯氨酸肽鍵折疊為限速步驟的蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，幫助蛋白質(zhì)維持穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。親環(huán)蛋白A在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中廣泛分布，并且在細(xì)胞中不同的部位，包括細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線(xiàn)粒體、細(xì)胞核等都有存在，發(fā)揮著重要的功能。本研究以在東北鹽堿土壤中分離獲得的小球藻為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建小球藻cDNA文庫(kù)并將其轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞，利用

2、NaCl抗性篩選獲得耐鹽酵母克隆，并對(duì)耐鹽克隆中的基因進(jìn)行功能研究。
　　通過(guò)對(duì)45個(gè)抗性克降的基因測(cè)序，最后獲得4個(gè)基因。根據(jù)相關(guān)理論知識(shí)，本研究選取親環(huán)蛋白（CyPA）基因，序列分析表明小球藻CyPA蛋白結(jié)構(gòu)保守，具有CyPA蛋白典型的結(jié)構(gòu)特征。CyPA蛋白在細(xì)胞中廣泛分布，本研究通在擬南芥原生質(zhì)體中研究小球藻CyPA在細(xì)胞中的定位情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CyPA定位于細(xì)胞總的特定部位。
　　為了進(jìn)一步研究CyPA基因是否與非

3、生物脅迫相關(guān)，研究首先利用Northern blot檢測(cè)小球藻在NaCl、NaHCO3以及Sorbital脅迫下，CyPA基因表達(dá)量的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CyPA基因受上述非生物脅迫的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。此外，利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法，獲得CyPA基因過(guò)表達(dá)的釀酒酵母，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得水稻以及擬南芥的CyPA基因過(guò)表達(dá)植株，并研究了過(guò)表達(dá)植株應(yīng)對(duì)非生物脅迫的能力，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)CyPA的酵母細(xì)胞能夠提高應(yīng)對(duì)鹽脅迫(NaCl)、堿性鹽脅迫(NaHCO3)

4、、氧化脅迫(H2O2)以及干旱脅迫(Sorbitol)的能力;過(guò)表達(dá)CyPA基因的擬南芥能夠提高應(yīng)對(duì)鹽脅迫(NaCl)和堿性鹽脅迫(NaHCO3)的能力;過(guò)表達(dá)CyPA基因的水稻能夠提高應(yīng)對(duì)鹽脅迫(NaCl)、堿性鹽脅迫(NaHCO3)以及Me-JA（茉莉酸甲酯）脅迫的能力。
　　為了鑒定小球藻CyPA蛋白具有肽酰脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(PPIase)活性，實(shí)驗(yàn)通過(guò)原核表達(dá)純化系統(tǒng)小量表達(dá)優(yōu)化最佳條件，并且純化出具有活性的CyPA蛋白，