小球藻親環(huán)蛋白A(CyPA)基因克隆與功能研究.pdf

1、親環(huán)蛋白A是結構保守的，具有肽酰脯氨酰順反異構酶(PPIase)活性的一類蛋白，可以催化肽鏈中Xaa-Pro肽鍵的順反折疊，促進體內以脯氨酸肽鍵折疊為限速步驟的蛋白構象發(fā)生變化，幫助蛋白質維持穩(wěn)定的三維結構。親環(huán)蛋白A在原核細胞和真核細胞中廣泛分布，并且在細胞中不同的部位，包括細胞質、葉綠體、線粒體、細胞核等都有存在，發(fā)揮著重要的功能。本研究以在東北鹽堿土壤中分離獲得的小球藻為實驗材料，構建小球藻cDNA文庫并將其轉入釀酒酵母細胞，利用

2、NaCl抗性篩選獲得耐鹽酵母克隆，并對耐鹽克隆中的基因進行功能研究。
　　通過對45個抗性克降的基因測序，最后獲得4個基因。根據相關理論知識，本研究選取親環(huán)蛋白（CyPA）基因，序列分析表明小球藻CyPA蛋白結構保守，具有CyPA蛋白典型的結構特征。CyPA蛋白在細胞中廣泛分布，本研究通在擬南芥原生質體中研究小球藻CyPA在細胞中的定位情況，實驗結果表明CyPA定位于細胞總的特定部位。
　　為了進一步研究CyPA基因是否與非

3、生物脅迫相關，研究首先利用Northern blot檢測小球藻在NaCl、NaHCO3以及Sorbital脅迫下，CyPA基因表達量的變化，實驗結果表明CyPA基因受上述非生物脅迫的誘導上調表達。此外，利用化學轉化法，獲得CyPA基因過表達的釀酒酵母，農桿菌介導法獲得水稻以及擬南芥的CyPA基因過表達植株，并研究了過表達植株應對非生物脅迫的能力，結果表明，過表達CyPA的酵母細胞能夠提高應對鹽脅迫(NaCl)、堿性鹽脅迫(NaHCO3)

4、、氧化脅迫(H2O2)以及干旱脅迫(Sorbitol)的能力;過表達CyPA基因的擬南芥能夠提高應對鹽脅迫(NaCl)和堿性鹽脅迫(NaHCO3)的能力;過表達CyPA基因的水稻能夠提高應對鹽脅迫(NaCl)、堿性鹽脅迫(NaHCO3)以及Me-JA（茉莉酸甲酯）脅迫的能力。
　　為了鑒定小球藻CyPA蛋白具有肽酰脯氨酰順反異構酶(PPIase)活性，實驗通過原核表達純化系統(tǒng)小量表達優(yōu)化最佳條件，并且純化出具有活性的CyPA蛋白，