miR-21體外轉(zhuǎn)染神經(jīng)元方案優(yōu)化及其在體外TBI模型中神經(jīng)保護作用的機制研究.pdf

1、目的：本研究首先通過在不同轉(zhuǎn)染條件下，包括不同的轉(zhuǎn)染溶劑、預(yù)處理和轉(zhuǎn)染試劑濃度，對miR-21在神經(jīng)元內(nèi)表達水平和神經(jīng)元損傷的檢測，建立一種穩(wěn)定、高效，并且對神經(jīng)元損傷較小的轉(zhuǎn)染方案。進一步通過轉(zhuǎn)染體外神經(jīng)元，并通過TBI模型來檢測miR-21在TBI過程中是否發(fā)揮抗凋亡作用并探索其可能的作用機制，為進一步的研究和顱腦創(chuàng)傷的臨床基因治療提供理論依據(jù)
　　方法：神經(jīng)元取自24小時的Wistar乳鼠，培養(yǎng)7天。標記FAM的miR-21

2、 Agomior用于檢測miR-21是否可以轉(zhuǎn)染進入神經(jīng)元。神經(jīng)元隨機分為5組：饑餓-DMEM（S-DMEM）組、非饑餓-DMEM（N-DMEM）組、饑餓-Neurobasal（S-Neurobasal）組和非饑餓-Neurobasal（N-Neurobasal）組和空白對照組（Sham）。miR-21 oligomers（20μM，2.5μl）與RNAiMAX(0.5/1/1.5/2/2.5μl)融合后，加入DMEM或Neurobas

3、al-A使轉(zhuǎn)染液達到500μl或250μl。饑餓組在轉(zhuǎn)染前，僅加入250μlDMEM或Neurobasal行饑餓1小時。然后將轉(zhuǎn)染液加入各組的到6孔板中轉(zhuǎn)染6小時，繼續(xù)培養(yǎng)48小時進行下一步的試驗分析。miR-21在神經(jīng)元內(nèi)的表達通過RT-PCR及miR-21靶基因PTEN和PDCD4的表達情況來檢測。同時為了避免miR-21的生物學(xué)作用對神經(jīng)元損傷的影響，將miR-21 agomir更換為miR-21 negative control

4、后，進行轉(zhuǎn)染后，通過TUNEL凋亡試劑盒和MTT試驗檢測神經(jīng)元損傷情況。按照上述轉(zhuǎn)染方案，將FAM標記的miR-21 agomir用于檢測miR-21的轉(zhuǎn)染效率。然后將細胞隨機分為5組：空白組，TBI組，TBI+miR-21 agomir(TBI-A)組, TBI+miR-21 antagomir(TBI-AN)組和TBI+miR-21 negative control(TBI-NC)組。miR-21 agomir, miR-21 an

5、tagomir和miR-21 negative control按相應(yīng)組進行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后48小時，除空白組外，分別進行劃痕損傷。劃痕損傷后24小時，各組神經(jīng)元內(nèi)miR-21和PTEN表示水平通過RT-PCT檢測；各組神經(jīng)元的凋亡情況通過TUNEL和MAP-2熒光雙染檢測。Western Blot檢測PTEN、總AKT、p-AKT，以及其下游凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、cleavaged caspase-3、Bcl-2和Bax的表達情況

6、。
　　結(jié)果：FAM-miR-21可以轉(zhuǎn)染進入神經(jīng)元。miR-21在 Neurobasal組中比DMEM組中表達明顯升高，同時RANiMAX在1.5μl時，miR-21的表達水平達到最高峰，繼續(xù)增加RANiMAX劑量沒有增高miR-21的表達水平。同時神經(jīng)元損傷具有條件依賴性和劑量依賴性，饑餓組凋亡細胞相對于非饑餓組明顯增加，同時相對于RNAiMAX: miR-21=4/5:5，RNAiMAX: miR-21=1/2/3:5的凋亡

7、神經(jīng)元明顯減少。隨后的試驗證明，劃痕損傷的神經(jīng)元引起TBI中相似的凋亡情況，并且miR-21 agomir/antagomir可以上調(diào)/下調(diào)神經(jīng)元中miR-21的表示水平。同時，TUNEL結(jié)果顯示：miR-21減少TBI損傷中TUNEL陽性細胞。對PTEN-AKT通路檢測發(fā)現(xiàn)：miR-21降低 PTEN的基因表達水平和蛋白表達水平，并且使p-KAT表達水平升高。Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示：miR-21減少caspa

8、se-9、cleavaged caspase-3和Bcl-2表達，而增加Bax在神經(jīng)元中的表達。
　　結(jié)論：miR-21轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的方案是以Neurobasal-A為溶劑，不經(jīng)過饑餓處理，在miR-21 agomir：RNAiMAX=3:5的比例下進行轉(zhuǎn)染；同時通過上調(diào)或者下調(diào)神經(jīng)元中miR-21表示水平發(fā)現(xiàn)，miR-21可以減少體外TBI模型中神經(jīng)元的凋亡，同時研究發(fā)現(xiàn)，miR-21是通過作用于PTEN-AKT通路，調(diào)節(jié)下游相關(guān)