褪黑素對體外Aβ誘導不同衰老程度海馬神經(jīng)元線粒體功能障礙保護作用差異的研究.pdf

1、研究背景：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種常見的與年齡相關的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。老年斑是AD的主要病理特征之一，β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid Protein，Aβ)是老年斑的主要成分，它是AD形成和發(fā)展的關鍵因素。Aβ通過多種途徑引發(fā)神經(jīng)毒性作用。體內(nèi)外實驗均證實：Aβ可導致線粒體功能障礙。大量證據(jù)表明：線粒體在AD發(fā)病過程中起重要作用。褪黑素(melatonin)是松果體分泌的一種吲哚類神經(jīng)

2、內(nèi)分泌激素，具有廣泛的生理作用。褪黑素在衰老及神經(jīng)退行性疾病方面的作用已受到廣泛關注。褪黑素具有親脂性和親水性的雙重特性，能穿過細胞膜，較易到達包括線粒體在內(nèi)的任何細胞器，并且能以較高濃度聚集在線粒體內(nèi)。褪黑素可與脂質雙分子層結合，穩(wěn)定線粒體內(nèi)膜，提高電子傳遞鏈活性。褪黑素可改善多種因素導致的線粒體功能障礙。有研究報道：不同年齡階段AD轉基因模型小鼠Tg2576應用褪黑素補充治療，其作用差異較大。在老年鼠，褪黑素抗Aβ和抗氧化效果不明顯

3、。而在年輕鼠，褪黑素具有較好的抗Aβ和抗氧化效果。我們前期在快速老化癡呆模型鼠SAMP8上的研究結果也證實：褪黑素對SAMP8小鼠學習記憶力的改善存在年齡差異，對年輕鼠效果較好，而對老年鼠效果不明顯?；谝陨涎芯拷Y果，我們推測：褪黑素對體外Aβ所致不同衰老程度神經(jīng)元損害的保護作用可能也存在差異，該作用差異可能與褪黑素對不同衰老程度神經(jīng)元線粒體保護作用不同有關。本課題將對這一推測開展研究，為臨床應用褪黑素防治AD提供理論基礎。
　　

4、 第一部分：長時程海馬神經(jīng)元培養(yǎng)中細胞衰老與線粒體功能關系的研究。
　　 目的：⑴觀察長時程原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)過程中，神經(jīng)元衰老情況。⑵觀察長時程原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)過程中，線粒體功能變化情況。⑶確定長時程培養(yǎng)過程中，出現(xiàn)具有線粒體功能障礙的典型衰老特征的時間。
　　 方法：①體外長時程海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，以倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況。②采用衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色，對培養(yǎng)5、10、15、20、25

5、和30天的海馬神經(jīng)元染色，顯微鏡觀察，計數(shù)。③以熒光探針羅丹明123染色，通過流式細胞儀檢測神經(jīng)元的線粒體膜電位。④以熒光探針DCFH-DA染色，通過流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧水平。⑤透射電鏡觀察培養(yǎng)神經(jīng)元的線粒體形態(tài)。⑥采用SPSS11.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，用單因素方差分析進行均數(shù)間的多重比較，以P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：⑴生長期(培養(yǎng)0-1

6、0天)：該期內(nèi)神經(jīng)元胞體逐漸增大，變飽滿，突起逐漸長出，直至分支明顯延長，相互交織成網(wǎng)絡。⑵隨著培養(yǎng)時間的延長，衰老神經(jīng)元的數(shù)目逐漸增多，培養(yǎng)5、10、15、20、25和30天的衰老神經(jīng)元占所觀測神經(jīng)元的百分比分別是6％、32％、53％、79％、90％和93％。⑶隨著培養(yǎng)時間的增加，神經(jīng)元的線粒體膜電位逐漸降低。培養(yǎng)5、15、20、25和30天的線粒體膜電位水平分別是培養(yǎng)10天海馬神經(jīng)元的102.2％、89.2％、72.1％、70.4％

7、和58.5％。⑷培養(yǎng)時間的延長，細胞內(nèi)活性氧水平逐漸升高，培養(yǎng)5、15、20、25和30天的細胞內(nèi)活性氧水平分別是培養(yǎng)10天海馬神經(jīng)元的83.0％、139.8％、148.9％、178.2％和215.4％。⑸電鏡結果顯示：培養(yǎng)10天海馬神經(jīng)元的線粒體結構正常，具有雙層膜，線粒體嵴平行排列。培養(yǎng)25天海馬神經(jīng)元的大多數(shù)線粒體腫脹，只有少數(shù)正常的線粒體，線粒體嵴數(shù)目變少及空泡形成。
　　 結論：①長時程海馬神經(jīng)元培養(yǎng)可用于細胞衰老的研

8、究。②長時程海馬神經(jīng)元培養(yǎng)過程中，線粒體功能逐漸降低，與衰老程度呈正相關。③培養(yǎng)第25天的海馬神經(jīng)元具有線粒體功能障礙的典型衰老特征。
　　 第二部分：褪黑素對體外Aβ誘導不同衰老程度海馬神經(jīng)元線粒體功能障礙的保護作用差異。
　　 目的：⑴觀察褪黑素對體外Aβ誘導不同衰老程度海馬神經(jīng)元損害的保護作用。⑵揭示褪黑素對體外Aβ誘導不同衰老程度神經(jīng)元的保護作用差異是否與褪黑素對線粒體作用不同有關。
　　 方法：①基于第

9、一部分的研究結果，我們選擇培養(yǎng)第10天和25天的海馬神經(jīng)元分別代表年輕神經(jīng)元和衰老神經(jīng)元。MTT法測定海馬神經(jīng)元的細胞活力。②以熒光探針羅丹明123染色，通過流式細胞術檢測線粒體膜電位。③采用反相高效液相色譜法檢測細胞內(nèi)ATP水平。④通過紫外分光光度法檢測線粒體呼吸鏈復合物活性。⑤采用SPSS11.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準(-x±s)表示，用單因素方差分析進行均數(shù)間的多重比較，以P＜0.05表

10、示有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：⑴MTT結果顯示：培養(yǎng)10天海馬神經(jīng)元，Aβ25-35組細胞活力較對照組降低(P＜0.05)，而褪黑素預處理組細胞活力高于Aβ25-35組(P＜0.05)；培養(yǎng)25天海馬神經(jīng)元，Aβ25-35組細胞活力較對照組降低(P＜0.05)，褪黑素預處理組(10-5-10-7)細胞活力與Aβ25-35組相比分別升高3.9％、2.6％和1.2％，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。⑵流式細胞術檢測結果：培養(yǎng)10天

11、海馬神經(jīng)元，Aβ25-35組細胞線粒體膜電位較對照組降低(P＜0.05)，而褪黑素預處理組線粒體膜電位高于Aβ25-35組(P＜0.05)；培養(yǎng)25天海馬神經(jīng)元，Aβ25-35組細胞線粒體膜電位較對照組降低(P＜0.05)，褪黑素預處理組線粒體膜電位與Aβ25-35組相比升高11.5％，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。⑶反相高效液相色譜法檢測結果提示：培養(yǎng)10天海馬神經(jīng)元，Aβ25-35組細胞ATP含量較對照組降低(P＜0.05)，而

12、褪黑素預處理組細胞ATP含量高于Aβ25-35組(P＜0.05)；培養(yǎng)25天海馬神經(jīng)元，Aβ25-35組細胞ATP含量較對照組降低(P＜0.05)，褪黑素預處理組細胞ATP含量與Aβ25-35組相比升高12.8％，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。⑷分光光度法檢測結果顯示：Aβ25-35誘導年輕和衰老海馬神經(jīng)元線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性均下降(P＜0.05)；褪黑素預處理可改善Aβ25-35誘導的年輕神經(jīng)元線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ

13、和Ⅳ活性降低，但對Aβ25-35所致的衰老神經(jīng)元線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ和Ⅳ活性下降無明顯作用(P＞0.05)。褪黑素預處理對Aβ25-35所致年輕和衰老神經(jīng)元線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ和Ⅲ的活性降低均無明顯影響。單純應用褪黑素不能提高年輕神經(jīng)元線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ和Ⅳ活性，但可改善衰老海馬神經(jīng)元線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ和Ⅳ活性。單純應用褪黑素對年輕和衰老神經(jīng)元線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ和Ⅲ活性均無明顯影響。
　　 結論：①褪黑素對體外Aβ25-3

14、5誘導年輕和衰老海馬神經(jīng)元損害的保護作用不同，即褪黑素對Aβ25-35誘導年輕海馬神經(jīng)元的損害有保護作用，而對Aβ25-35誘導衰老海馬神經(jīng)元的損害無明顯影響。②褪黑素可改善Aβ25-35誘導年輕海馬神經(jīng)元的線粒體功能損害(線粒體膜電位下降，ATP含量降低及線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ和Ⅳ活性降低)，但對Aβ25-35誘導衰老海馬神經(jīng)元的線粒體功能損害無明顯作用。③褪黑素對Aβ25-35誘導年輕和衰老海馬神經(jīng)元損害的保護作用差異可能與褪黑素對年