不同時機(jī)針刺介入對TBI模型大鼠腦神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)理研究.pdf

1、目的
　　1．使用eCCI儀器，研究制備顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）大鼠動物模型，為針刺治療TBI實驗研究提供操作可控、損傷程度穩(wěn)定、重復(fù)性好、死亡率低的模型制備方法。
　　2．利用該方法制備SD大鼠TBI模型，研究不同時間點針刺介入治療TBI的效果，揭示針刺干預(yù)對TBI動物神經(jīng)元的保護(hù)作用及部分機(jī)理，為臨床針刺治療TBI的最佳介入時間提供實驗依據(jù)、豐富針刺治療TBI的科學(xué)內(nèi)涵。
　

2、　方法
　　1．選用65只SD大鼠，隨機(jī)分為空白對照組、模型1組、模型2組、模型3組和假手術(shù)組，使用eCCI選定不同打擊參數(shù)（模型1組速度3m/s、深度3mm；模型2組速度4m/s、深度3mm；模型3組速度5m/s、深度3mm）制備不同損傷程度的TBI模型，通過以下幾方面評測模型的制備效果：
　?。?）動物神經(jīng)功能、平衡能力和行走能力評價。
　?。?）HE染色光鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)改變情況。
　?。?）電鏡觀察腦

3、組織超微結(jié)構(gòu)的變化。
　?。?）ELISA法檢測動物血清中S100B、NSE含量的動態(tài)變化。
　　（5）免疫組化法檢測腦組織NGF、BDNF表達(dá)情況。
　?。?）免疫組化法檢測腦組織Bax、Bcl-2表達(dá)情況。
　　2．選用70只SD大鼠，隨機(jī)分為空白對照組、針刺1組、針刺2組、針刺3組和模型對照組，使用eCCI儀器，選用打擊參數(shù)為速度4m/s、深度3mm制備TBI動物模型。取百會、人中、內(nèi)關(guān)（左側(cè)）和足三里（左

4、側(cè)），分別在腦損傷后第1日、第3日、第5日開始針刺治療，各組治療持續(xù)10次，等待結(jié)束點，在第15日取材，觀察、檢測相關(guān)指標(biāo)：
　?。?）光鏡下HE染色觀察腦組織病理改變情況。
　?。?）免疫組化法、Western-blot法檢查腦組織中NGF、BDNF蛋白的定位、含量及熒光定量PCR法檢測NGFmRNA、BDNF mRNA的表達(dá)變化。
　?。?）免疫組化法、Western-blot法檢查腦組織中 Bcl-2、Bax蛋白

5、的定位、含量及熒光定量PCR法檢測Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1. TBI模型大鼠制備研究
　?。?）SD大鼠顱腦受到不同速度的外力打擊后，模型1組、模型2組、模型3組出血量均隨打擊強(qiáng)度增加而增多，呼吸減慢，死亡動物數(shù)隨之上升。于打擊后第1日，對其神經(jīng)功能、平衡能力、行走能力進(jìn)行評價，結(jié)果顯示神經(jīng)功能、平衡能力、行走能力均隨打擊速度的增加而下降，且各組間有顯著性差異（P<0.01

6、）；于第3日進(jìn)行評估，各組神經(jīng)功能、平衡能力、行走能力均較第1日明顯改善，但各組之間仍存在顯著性差異（P<0.01）。
　　（2）采用HE染色光鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化，空白組和假手術(shù)組腦組織皮層細(xì)胞分布清晰致密、排列均勻、胞體飽滿、胞核呈藍(lán)色、輪廓清楚、神經(jīng)元染色正常；模型各組受傷皮質(zhì)可見不同程度紅細(xì)胞溢出、大量炎性細(xì)胞浸潤、間質(zhì)水腫、組織疏松、血管周圍間隙增寬，且隨打擊強(qiáng)度增加而明顯加重。
　?。?）電鏡觀察腦組超微結(jié)構(gòu)

7、變化，正常組和假手術(shù)組神經(jīng)元整體結(jié)構(gòu)完整、清晰，線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器含量豐富，線粒體具有清晰可見的內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)、嵴排列整齊；而模型各組神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、溶解，胞漿變少，細(xì)胞器含量減少，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹等，且隨打擊力度增加而加重。
　?。?）ELISA法動態(tài)檢測血清中 S100B、NSE含量的變化，模型各組動物當(dāng)損傷發(fā)生后第1日、第2日、第3日均呈上升趨勢，同空白組和假手術(shù)組比較均有顯著性差異（P<0.01）；模型

8、1組、模型2組、模型3組之間表現(xiàn)為隨打擊力度的增加S100B、NSE含量顯著性增高，且各組之間具有顯著性差異（P<0.01）。
　　（5）免疫組化法檢測腦組織中NGF、BDNF、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況。陽性表達(dá)物主要分布在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，以小顆粒為主、部分呈現(xiàn)為聚集分布?？瞻捉M和假手術(shù)組大鼠損傷腦組織大腦皮質(zhì)、海馬及小腦神經(jīng)元胞漿中NGF、BDNF、Bax、Bcl-2均有弱陽性反應(yīng)。模型各組損傷后腦組織損傷區(qū)大腦皮質(zhì)、海馬、小

9、腦神經(jīng)元胞漿中NGF、BDNF、Bax、Bcl-2呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，表達(dá)明顯增多，且隨損傷打擊速度的增加而增多，各組之間具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。
　　2.不同時機(jī)針刺介入治療TBI對腦組織NGF、BDNF、Bax和Bcl-2調(diào)控的研究。
　　（1）HE染色腦組織形態(tài)學(xué)變化?？瞻捉M腦神經(jīng)細(xì)胞密集，可清楚地看到細(xì)胞的大體形態(tài)；模型組皮層神經(jīng)細(xì)胞較少、神經(jīng)元皺縮、胞質(zhì)深染、核不清晰，有壞死神經(jīng)細(xì)胞；針刺各組膠質(zhì)細(xì)胞增多、凋亡小

10、體減少、壞死細(xì)胞明顯減少，神經(jīng)元形態(tài)接近正常，壞死面積縮小，血液循環(huán)明顯改善。
　?。?）采用免疫組化檢測腦組織中NGF、BDNF、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)定位及含量，又結(jié)合Western-blot定量檢測其蛋白含量變化，針刺可上調(diào)腦組織損傷皮質(zhì)中NGF、BDNF、Bcl-2蛋白的含量、下調(diào)腦組織損傷皮質(zhì)中Bax蛋白的含量；同時，熒光定量PCR檢測也發(fā)現(xiàn)，針刺可上調(diào)腦組織損傷皮質(zhì)中NGF、BDNF、Bcl-2相應(yīng)基因mRNA含量

11、、下調(diào)腦組織損傷皮質(zhì)中Bax基因mRNA含量，且針刺1組優(yōu)于針刺2組、針刺3組，組間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.利用eCCI儀器制備TBI模型大鼠能夠通過打擊速度、打擊深度參數(shù)的設(shè)置而精確控制模型的損傷程度，具有易操作、打擊強(qiáng)度可控制、重復(fù)性好、死亡率可控等優(yōu)點，能夠根據(jù)研究需要制備各種理想損傷程度的動物模型。
　　2. TBI后針刺介入治療的時間點應(yīng)盡可能早，更有利于發(fā)揮針刺上調(diào)腦組織神