探索FHL2在斑馬魚中的同源基因?qū)ζ浒l(fā)育的影響.pdf

1、目的/背景：
　　 FHL2(fburandhalfLIMdomainprotein)是僅有LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),屬于LIM蛋白家族成員。它由四個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域組成,每個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域包括兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)提示LIM家族成員可能較為廣泛的參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)之間的相互作用并影響細(xì)胞的各種生物學(xué)行為。在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大腸癌都發(fā)現(xiàn)FHL2的高表達(dá)。體外研究發(fā)現(xiàn)FHL2在多株胃腸癌細(xì)胞株中高表達(dá),抑制FHL2可誘導(dǎo)癌細(xì)胞的分化。此

2、外,近來有研究發(fā)現(xiàn),FHL2在脈管組織的發(fā)生過程中可能起一定作用,在包括主動(dòng)脈弓部(aorticarcharteries)、背側(cè)大動(dòng)脈(dorsalaorta)以及節(jié)間動(dòng)脈(intersegmentalarteries,IA)的胚胎發(fā)生發(fā)育過程中均檢測(cè)到其表達(dá),在心臟的各個(gè)房室間隔(compartments)中亦得到表達(dá)。小鼠中與人類FHL2同源基因的表達(dá)與其傷口愈合的快慢呈顯著正相關(guān)關(guān)系,其表達(dá)集中于傷口肉芽組織的纖維樣細(xì)胞中。這些結(jié)

3、果提示,FHL2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用可能有賴于其對(duì)血管生成的影響。近來有研究顯示,FHL2的表達(dá)跟某些惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,其機(jī)制可能涉及了對(duì)血管生成(Angiogenesis)的干預(yù)。因此,對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步深入研究具有明確的科學(xué)意義和潛在的臨床意義。斑馬魚是脊椎動(dòng)物,也是一種研究廣泛的模式生物,其基因組以及發(fā)育過程與人類具有比較高的同源性和相似性。此外,對(duì)于斑馬魚胚胎期的基因表達(dá)干預(yù),已經(jīng)建立了一些比較成熟可靠的實(shí)驗(yàn)方法,可

4、以有效改變某個(gè)特定基因的表達(dá)水平,譬如利用Morpholino策略干擾胚胎發(fā)育早期的基因表達(dá)。Fli-1是一個(gè)轉(zhuǎn)基因的斑馬魚品系,通過它可以在活體實(shí)現(xiàn)對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的血管系統(tǒng)進(jìn)行不問斷的觀察:flil啟動(dòng)子可以在斑馬魚的的整個(gè)胚胎發(fā)生的過程中介導(dǎo)EGFP(TheEnhancedGreenFluorescentProteins,增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)在所有血管組織的表達(dá)。人類FHL2在斑馬魚中確實(shí)具有同源性較高的基因,且這個(gè)基因在胚

5、胎發(fā)育的初期既有一定程度的轉(zhuǎn)錄。這一現(xiàn)象提示,該基因可能在斑馬魚的胚胎發(fā)育早期就起到一定作用。因此,我們應(yīng)用斑馬魚這一生物模型從一個(gè)特定的角度來探索人類FHL2基因的功能。
　　 方法
　　 1.利用TIGRGeneIdices和NCBI的BLAST在線比對(duì)軟件,搜尋人類FHL2在斑馬魚中的同源基因,并對(duì)兩者的相似性進(jìn)行分析。
　　 2.委托美國(guó)GeneTools公司設(shè)計(jì)并合成兩段針對(duì)該斑馬魚基因的morphol

6、inooligonucleotides；理論上,其中之一的作用在于抑制基因的表達(dá)、翻譯,另一個(gè)則能夠干擾轉(zhuǎn)錄本的正常剪切并可能最終得到長(zhǎng)度異常的靶基因轉(zhuǎn)錄本,指導(dǎo)翻譯出長(zhǎng)度及序列異常的蛋白質(zhì)。
　　 3.通過顯微注射將morpholino導(dǎo)入斑馬魚的受精卵；
　　 4.通過RT-PCR檢測(cè)人類FHL2在斑馬魚中的同源基因zgc:92428在morpholino作用下其mRNA水平的改變；通過RT-PCR檢測(cè)zgc:924

7、28基因在斑馬魚不同的胚胎發(fā)育期的表達(dá)。
　　 5.通過顯微注射將morpholino導(dǎo)入斑馬魚的受精卵后觀察其生長(zhǎng)發(fā)育情況,并通過熒光顯微鏡觀察斑馬魚胚胎循環(huán)系統(tǒng)的發(fā)育情況。同時(shí),把48hpf作為時(shí)間點(diǎn),計(jì)數(shù)了其中產(chǎn)生明顯肉眼可見缺陷的胚胎以及存活的胚胎,并計(jì)算缺陷率和存活率,采用配對(duì)設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)以比較5個(gè)實(shí)驗(yàn)循環(huán)中對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的差別,并且當(dāng)P≤0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1)人類

8、FHL2基因與斑馬魚中代號(hào)為Danioreriozgc:92428的基因具有高度同源性。2)人類FHL2在斑馬魚中的同源基因zgc:92428在斑馬魚胚胎發(fā)育早期有表達(dá)。3)用反義morpholino寡聚核苷酸在斑馬魚胚胎中抑制了與人類FHL2同源的基因zgc:92428的mRNA水平。4)斑馬魚中的受精卵中已經(jīng)攜有來自母體的zgc:92428基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本。5)FHL2-MOATG和FHL2-MOE3D可導(dǎo)致斑馬魚胚胎的發(fā)育阻滯

9、及異常,這些異常都伴有斑馬魚胚胎脈管系統(tǒng)的發(fā)育阻滯,其中FHl2-MOATG還能增加胚胎的死亡率。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)確定了人類FHL2基因與斑馬魚中代號(hào)為Danioreriozgc:92428的基因具有高度同源性。
　　 2.反義morpholino寡聚核苷酸在斑馬魚胚胎中可降低與人類FHL2同源的基因zgc:92428的mRNA水平,可能可抑制其轉(zhuǎn)錄。
　　 3.利用RT-PC