Nrxn2a在鉛誘導的斑馬魚神經發(fā)育毒性中的作用.pdf

1、目的:長期低劑量的鉛暴露可引起神經系統(tǒng)損傷，對處于生長發(fā)育階段的嬰幼兒尤甚，并可進一步引起神經系統(tǒng)紊亂以及行為改變。在神經生長發(fā)育過程中，突觸粘附分子發(fā)揮著重要的作用，但其在鉛的神經發(fā)育毒性中的作用尚不明確。本研究通過觀察鉛暴露對斑馬魚神經系統(tǒng)發(fā)育的影響，以探索斑馬魚突觸粘附分子在鉛暴露作用下的表達改變以及在斑馬魚行為改變中的作用。
　　方法:1.觀察單細胞期不同劑量的醋酸鉛(Pb(CH3COOH)2)暴露對斑馬魚胚胎/幼魚死亡、

2、畸形、孵化的影響;
　　2.采用吖啶橙(Acridine Orange)染色法觀察受精后3天(3dpf)斑馬魚全魚細胞凋亡狀況;
　　3.使用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)測定鉛的斑馬魚內暴露含量;
　　4.利用ViewPoint Zebrabox行為測試系統(tǒng)觀測斑馬魚幼魚自發(fā)運動行為變化。
　　5.通過q-PCR以及全魚原位雜交(In-Situ Hybridization，ISH)技術定量及定位24hp

3、f，48hpf以及72hpf斑馬魚體內各亞型neurexin（nrxn）以及72hpf部分突觸粘附分子mRNA表達水平與空間表達狀況;
　　6.采用顯微注射技術于斑馬魚胚胎單細胞期注射人工合成的nrxn2ab mRNA進行進行拯救實驗(rescue experiment)，進一步觀察過表達nrxn2ab mRNA后，鉛暴露下斑馬魚胚胎/幼魚的死亡、畸形、孵化狀況，凋亡發(fā)生，nrxn2aa與nrxn2ab表達變化以及行為學改變。

4、r>　　結果:1.隨著鉛暴露劑量的增加，斑馬魚胚胎死亡率和畸形率有不同程度的升高。持續(xù)暴露至120hpf時，最高受試劑量(10μmol/L)引起斑馬魚幼魚死亡率約為18％;鉛暴露可使斑馬魚出現(xiàn)多種畸形表型，主要表現(xiàn)為脊柱彎曲畸形，于120hpf畸形率達26％。
　　2.AO染色凋亡顯示斑馬魚幼魚凋亡水平隨著暴露劑量的增加而升高，其中凋亡發(fā)生主要聚集于頭部、心包以及魚鰭等區(qū)域。在NBT-DsRed轉基因魚系（特異性標記神經元）中，鉛

5、暴露引起較明顯的神經系統(tǒng)凋亡;
　　3.ICP-MS結果顯示鉛有較強的生物蓄積作用，并伴有劑量效應關系;
　　4.在行為學觀察中，可見在受試濃度下的斑馬魚的自發(fā)運動受到了抑制，表現(xiàn)為總運動位移的減少、活動比例以及平均速度的降低，并隨著暴露劑量的升高而運動行為抑制增加。
　　5.通過qPCR檢測鉛暴露對受試突觸粘附分子mRNA水平表達的影響，結果顯示僅nrxn2a基因表達受到鉛暴露的影響。qPCR和原位雜交實驗展示了斑馬

6、魚各亞型的nrxn的mRNA水平表達狀況。鉛暴露于各測試時間點對nrxn2aa和nrxn2ab的表達均具有較明顯的抑制作用。其中鉛暴露于24hpf誘導了nrxn1a和nrxn3a的表達并于48hpf產生抑制作用，而至72hpf則無明顯改變。
　　6.在拯救實驗中，觀察nrxn2ab mRNA注射后斑馬魚胚胎生長發(fā)育狀況，發(fā)現(xiàn)mRNA注射可明顯減少鉛暴露導致的脊柱畸形發(fā)生同時降低神經系統(tǒng)（NBT-dsRed轉基因魚）和全魚（野生型）