SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp14基因的克隆表達(dá)及其作用底物的制備.pdf

1、本研究通過對(duì)SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp14基因進(jìn)行克隆，原核表達(dá)得到了Nsp14蛋白，并為Nsp14蛋白功能的檢測(cè)制備了底物。 試驗(yàn)一、SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp14基因的克隆。根據(jù)Genebank公布的SARS冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp14的基因序列設(shè)計(jì)引物，用PCR的方法把Nsp14基因從SARS冠狀病毒的cDNA片段中擴(kuò)增出來，將目標(biāo)基因連接到原核表達(dá)載體(pET30a)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切反

2、應(yīng)進(jìn)行了初步鑒定，并將初步鑒定后的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，克隆的Nsp14基因序列與發(fā)表基因完全一致，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30a-Exo。 試驗(yàn)二、對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp14進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)和純化。把構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET30a-Exo轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體的形式存在。對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp14的表達(dá)和純化條件進(jìn)行了優(yōu)化。使用多步洗滌的方法對(duì)包涵體進(jìn)行了初步純化