SARS冠狀病毒S糖蛋白在HeLa細(xì)胞中表達(dá)的研究.pdf

1、目的:探索SARS冠狀病毒(SARS-CoV)S糖蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位及其相關(guān)功能.方法:分別構(gòu)建融合有綠色熒光蛋白(GFP)基因或HA多肽抗原基因的SARS-CoV S糖蛋白全長cDNA質(zhì)粒,測序得到該實(shí)驗(yàn)SARS-CoV樣本S糖蛋白的基因序列圖譜.利用生物信息學(xué)方法分析該樣本S糖蛋白的基因序列,尋找到新的突變位點(diǎn),繪制進(jìn)化樹.通過預(yù)測S糖蛋白的普通物理化學(xué)性質(zhì),為下一步實(shí)驗(yàn)提供相關(guān)信息和指導(dǎo).利用非病毒性載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,

2、在激光共聚焦熒光掃描顯微鏡下,觀察融合了GFP的SARS-CoV S糖蛋白(SGFP)的亞細(xì)胞定位;同時(shí)利用SARS患者康復(fù)血清和HA抗體進(jìn)行蛋白印跡雜交,確定SARS-CoV S糖蛋白在真核細(xì)胞中的存在形式.結(jié)果:成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒GFPS-PCS,SGFP-PCS,HAS-pCDNA,SHA-PCS,分別將GFP基因或HA多肽抗原基因融合到SARS-CoV S糖蛋白基因的N端和C端.通過生物信息學(xué)分析預(yù)測,SARS-CoV S糖蛋白

3、基因具有高度的突變能力,其分子量大小為139KD,等電點(diǎn)(PI)為5.54,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定,并具有兩個(gè)螺旋化螺旋結(jié)構(gòu)(coiled-coil).在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn),通過非病毒載體轉(zhuǎn)染的SGFP融合蛋白的熒光彌散于整個(gè)HeLa細(xì)胞內(nèi),尤以細(xì)胞核區(qū)和胞漿區(qū)較為密集,而沒有集中定位于細(xì)胞膜上.這種定位分布不隨蛋白表達(dá)時(shí)間延長而發(fā)生顯著變化.蛋白印跡雜交顯示在70~90KD的區(qū)域有特異性條帶.結(jié)論:利用非病毒性載體在HeLa細(xì)胞中表達(dá)