豬δ冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp15抑制IFN--β產(chǎn)生的機制研究.pdf

1、豬δ冠狀病毒(PDCoV)是近年發(fā)現(xiàn)的一種豬腸道冠狀病毒,主要引起仔豬腹瀉和腸道損傷。PDCoV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒,屬于套式病毒目,冠狀病毒科,δ冠狀病毒屬成員。全長基因組約25.4kb,其基因組序列為5'UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-N-NS7-NS7a-3'UTR,編碼15個非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp2-nsp16),4個結(jié)構(gòu)蛋白和3個特異性輔助蛋白。研究證實感染脊椎動物的套式病毒目病毒(冠狀病毒科和動脈炎病

2、毒科)編碼的內(nèi)切核糖核酸酶(又稱為NendoU)較為保守,在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起著關(guān)鍵作用,并且已證實部分冠狀病毒的內(nèi)切核糖核酸酶(nsp15)和動脈炎病毒的同源蛋白nsp11能夠拮抗干擾素(IFN)的產(chǎn)生。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)PDCoV通過抑制RIG-I信號轉(zhuǎn)導(dǎo)拮抗IFN-β的產(chǎn)生,而PDCoV nsp15是否參與拮抗IFN-β的產(chǎn)生尚不清楚?；诖?本課題以PDCoV nsp15作為研究對象,探究其對IFN-β產(chǎn)生的影響以及具體的作用

3、機制。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.PDCoV nsp15呈劑量依賴性抑制IFN-β的產(chǎn)生
　　將不同劑量的PDCoV nsp15真核表達質(zhì)粒與IFN-β熒光素酶報告質(zhì)粒IFN-β-Luc、內(nèi)參質(zhì)粒pTK-Luc分別共轉(zhuǎn)染LLC-PK1和HEK-293T細胞,通過雙熒光素酶活性分析和RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)PDCoV nsp15顯著抑制仙臺病毒(SeV)誘導(dǎo)的IFN-β啟動子激活以及IFN-βmRNA表達,并且呈劑量依賴性,提示

4、PDCoV nsp15具有拮抗IFN-β產(chǎn)生的特性。
　　2.PDCoV nsp15主要抑制NF-κB的活化
　　IRF3和NF-κB是調(diào)控IFN-β產(chǎn)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,為了探究PDCoV nsp15是否影響它們的活化從而拮抗IFN-β的產(chǎn)生,將nsp15的真核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染LLC-PK1和HEK-293T細胞,通過雙熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)nsp15顯著抑制SeV誘導(dǎo)的NF-κB活化并呈劑量依賴性,但對SeV誘導(dǎo)的IRF3的

5、活化無顯著影響;IRF3和p65的磷酸化及其核轉(zhuǎn)運分別是IRF3和NF-κB激活的標(biāo)志,Western blot和間接免疫熒光(IFA)試驗結(jié)果表明nsp15蛋白主要抑制SeV誘導(dǎo)的p65磷酸化和入核,不影響IRF3的磷酸化和入核。表明PDCoV nsp15主要通過抑制NF-κB的活化拮抗IFN-β的產(chǎn)生。
　　3.PDCoV nsp15的關(guān)鍵酶活位點為His219、His234和Lys269
　　根據(jù)PDCoV和其他冠狀病

6、毒nsp15的氨基酸序列同源性比對及結(jié)構(gòu)同源性分析,推測PDCoV的NendoU結(jié)構(gòu)域活性催化氨基酸位點為His219(H219)、His234(H234)和Lys269(K269)。通過定點突變的方法獲得3個突變的nsp15基因,并將其和野生型nsp15基因分別克隆至原核表達載體中,獲得重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-nsp15以及相應(yīng)的突變體質(zhì)粒(pGEX-6P-1-H219A/H234A/K269A),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達、純化后,利用

7、熒光共振能量轉(zhuǎn)移試驗(FRET)分析發(fā)現(xiàn),與nsp15野生型蛋白相比,3個突變體蛋白的NendoU活性顯著降低,說明His129、His234和Lys269是PDCoVnsp15的關(guān)鍵酶活位點。
　　4.PDCoV nsp15抑制IFN-β的產(chǎn)生不依賴其內(nèi)切核糖核酸酶活性
　　有報道某些冠狀病毒nsp15和動脈炎病毒nsp11拮抗I型IFN的產(chǎn)生依賴其內(nèi)切核糖核酸酶活性;也有研究表明動脈炎病毒nsp11潛在的細胞毒性會影響I

8、FN的產(chǎn)生。為了探討PDCoV nsp15對IFN-β產(chǎn)生的抑制作用是否依賴于其內(nèi)切核糖核酸酶活性及細胞毒性,首先檢測了PDCoV nsp15野生型和突變體的細胞毒性,發(fā)現(xiàn)野生型對細胞有一定的毒性作用,3種突變體對細胞幾乎沒有毒性。在此基礎(chǔ)上,將表達PDCoV nsp15野生型及突變體(H219A、H234A和K269A)的真核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染LLC-PK1和HEK-293T細胞,通過雙熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn),3個突變體與野生型一樣均顯著