放線菌來源的堿性蛋白酶分離純化，酶學(xué)特性及其基因克隆表達(dá)的研究.pdf

1、堿性蛋白酶(EC3.4.21)具有很多重要特殊的性質(zhì)，如耐高溫、堿性試劑、表面活性劑以及有機試劑等，因此被廣泛的用作洗滌添加劑、食品增味劑、皮革的脫毛和軟化等。商品化的微生物蛋白酶制劑與堿性蛋白酶相比，其性質(zhì)存在顯著的不穩(wěn)定性。另外，目前工業(yè)化應(yīng)用的蛋白酶產(chǎn)品絕大多數(shù)來源于芽孢桿菌屬，放線菌來源的堿性蛋白酶極少并且被人們所忽視。因此，從放線菌資源中篩選產(chǎn)堿性蛋白酶菌株，對于豐富蛋白酶資源以及擴大工業(yè)化的實際應(yīng)用具有很重要的意義。

2、　　本實驗從采集的土樣中進(jìn)行分離產(chǎn)堿性蛋白酶放線菌菌株，通過菌落在舍有酪蛋白的高氏培養(yǎng)基上產(chǎn)生的透明圈的大小進(jìn)行初篩，再通過對酶活測定進(jìn)行復(fù)篩，最后得到一株產(chǎn)較高活性堿性蛋白酶的菌株，其在初始培養(yǎng)基中的蛋白酶活性達(dá)到138 U/mL。通過16S rDNA序列進(jìn)行分析得出，該菌株為Streptomyces sp.，被命名為Streptomyces sp.M30。
　　為了能夠使Streptomyces sp.M30達(dá)到最大產(chǎn)酶量，對

3、發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源含量及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的高氏培養(yǎng)基成分為:8g/L可溶性淀粉，1.7 g/L KCl，0.5 g/L KNO3,0.5 g/L Na2HPO4·12H2O,0.5 g/L MgSO4,0.02 g/L CaCO3,0.01 g/LFeSO4;培養(yǎng)條件為:初始pH7.0，接種量10‰培養(yǎng)溫度20℃，優(yōu)化后酶活為313U/mL，是優(yōu)化前的2.3倍，酶活提高了127％。
　　發(fā)酵培養(yǎng)后，對發(fā)酵液上清中粗酶酶學(xué)性質(zhì)

4、進(jìn)行了的研究。粗酶液的最適反應(yīng)溫度為80℃，在0-50℃溫度范圍內(nèi)酶活沒有影響，在60℃保溫2.5 h，殘留酶活在85％以上。最適pH為9.0，在pH4.0-9.0范圍內(nèi)均保持良好的穩(wěn)定性。不同的金屬離子對酶活性幾乎沒有影響。根據(jù)該堿性蛋白酶的性質(zhì)，該堿性蛋白酶被命名為SapH。
　　堿性蛋白酶SapH純化步驟為:硫酸銨沉淀(0-100％)，疏水柱層析，陰離子交換柱層析。純化后該堿性蛋白酶的比活力為29071.8 U/mg，純化倍

5、數(shù)為4.7倍，酶活力回收率為3.6‰通過質(zhì)譜分析得出蛋白分子量為54.7 kDa，該堿性蛋白酶SapH的Km和Vmax分別為35.71 mg/mL，5×104 U/mg。通過對純酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究表明，SapH的最適反應(yīng)溫度為80℃，在70-85℃均具有很高的活性，在0-40℃溫度范圍內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性，在50℃保溫2h，酶活性保留65％以上，60℃保溫30 min，殘留酶活力在40％以上。SapH的最適反應(yīng)pH為9.0，在pH4.0

6、-10.0范圍內(nèi)能保持很好的穩(wěn)定性，在pH6.0-10.0其酶活均能保持在90％以上。PMSF能完全抑制酶的活性，表明SapH為絲氨酸蛋白酶家族。Cu2+，Mn+，Ni2+均能提高酶的活性，相對酶活分別達(dá)到147％，113％，112％; EDTA，EGTA，DTT對酶活性具有很強的抑制作用。另外，該酶在DMF，DMSO，methanol， acetone等溶劑中均保持很高的活性，非金屬離子表面活性劑Tween80能使酶活性提高至121％