豬胸膜肺炎放線桿菌蛋白酶的分離提純及特性研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(PorcinePleuropneumonia)是由胸膜肺炎放線杼菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一種常見的呼吸道傳染病，各年齡的豬只均可感染。豬群感染胸膜肺炎放線桿菌后，當遇到氣候環(huán)境突變，通風不良等應激因素時，豬只抵抗力下降，可誘發(fā)本瘸，主要表現(xiàn)為精神沉郁，體溫升高，呼吸困難等臨床癥狀，并出現(xiàn)特征性的出血性肺炎和胸膜炎。本病在世界各養(yǎng)豬國家普遍存在，近年來，流行日趨嚴重

2、，成為世界規(guī)模化養(yǎng)豬的五大重要疫病之一，造成了巨大的經濟損失。 構成APP致病性的毒力因子包括溶盤毒素(Apx)、英膜多糖(CP)、脂多糖(LPS)、外膜蛋自(OMP)、轉鐵結合蛋自(Tbp)、滲透因子、脲素酶(Urase)、蛋白酶(Protease)等。然而，關于細菌的增殖和組織降解的很多問題都還沒有解決。蛋白酶很可能通過降解不同的宿主底物(如IgA、IgG)來促進呼吸器官粘膜表面組織的損傷，加快APP的進一步侵入。Negre

3、teAbascalE(1994)等已分離到能分泌切割免疫球蛋白蛋白酶的APP。在本研究中我們檢測了APP在體外培養(yǎng)時分泌的蛋白酶的一些生化特性。這些蛋白酶在宿主組織內也能分泌，且促進了組織的損傷和細菌的增殖(NegreteAbascalEeta1.，2000:NegreteAbascalEeta1.，1998)。因此，研究APP蛋白酶的生化特性，對有效預防和控制豬傳染性胸膜肺炎，保護和促進養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。 本研究共

4、分兩部分： 第一部分：豬胸膜肺炎放線桿菌蛋白酶的分離、純化及特性分析 將盤清7型豬胸膜肺炎放線桿菌(APP)出東分離株接種子含0.2％NAD的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h后，經硫酸銨鹽析、DEAE-纖維素離子交換層櫥、葡聚糖凝膠分子篩層析，從其培養(yǎng)上清液中分離純化了一種蛋白酶。SDS-PAGE顯示，APP蛋白酶含有分子量約為45kD的亞單位。以酪蛋白為底物測得該酶的最適pH值為7.5，最適溫度為45℃；該酶對熱有一定

5、穩(wěn)定性，80℃加熱30min仍保留部分活性；乙二胺四乙酸(EDTA)可抑制其活性，而苯甲基磺酰氟(PMSF)對其無影響。 第二部分：豬胸膜肺炎放線桿菌蛋白酶的免疫保護研究 將提純的APP蛋白酶制備成亞單位油乳劑疫苗，分不同劑量(10μg/只、20μg/只、30μg/只、40μg/只、50μg/只、100μg/只和200μg/只)免疫小白鼠，然后進行同源性保護試驗。結果顯示蛋白酶在100μg/只以上的免疫劑量下對小白鼠產生

6、較強的保護作用。用同源菌株攻毒后，對照組未經免疫直接攻毒的小白鼠全部死亡，肺臟嚴重出血，肝臟腫大出血；10μg免疫組的小白鼠全部死亡，肺臟嚴重出血；20μg、30μg、40μg、50μg、100μg、200μg免疫組的小白鼠死亡率隨免疫劑量的增加依次呈下降趨勢，肺臟出血程度也依次減輕。 在最佳免疫劑量下免疫30日齡小白鼠，間隔2周加強免疫一次。每次免疫后采血檢測蛋白酶的抗體，第二次免疫2周后用豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型、7型菌