膠原蛋白酶的純化及其基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、膠原蛋白酶(collagenolytic protease)是指能降解天然非變性膠原的一類酶.在醫(yī)學(xué)研究中可用于治療椎間盤突出癥等,實(shí)驗(yàn)室研究中作為工具酶應(yīng)用于細(xì)胞和器官的分離,基礎(chǔ)研究中可應(yīng)用于膠原結(jié)構(gòu)的研究,工業(yè)開發(fā)中可應(yīng)用于膠原分級(jí)降解以獲得膠原多肽,具有重要的理論研究意義和應(yīng)用研究價(jià)值.微生物和動(dòng)物組織來源的膠原蛋白酶已經(jīng)有廣泛的研究,至少從不同細(xì)菌和真菌中獲得40余種膠原蛋白酶,但由于它們大多來源于致病菌株,目前能夠商業(yè)化生產(chǎn)

2、的膠原蛋白酶的菌株很少.本實(shí)驗(yàn)從成都皮革廠等經(jīng)常堆積廢棄毛皮、皮革的場所采集土樣,通過富集、初篩、牛皮消化試驗(yàn)和膠原蛋白酶活性測定等方法,獲得12株具有膠原蛋白酶活性的菌株.通過形態(tài)觀察、生理生化特征分析及BIOLOG微生物鑒定儀鑒定,分別鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudumonas aeraginosa)和火神發(fā)光桿菌(Photobacterium logei).根據(jù)膠原蛋白酶PAC-SubA亞基N末端測序結(jié)果和同源性分析,設(shè)計(jì)了PCR

3、引物擴(kuò)增出并克隆到SubA亞基的全基因.測序結(jié)果顯示,該片段全長2011bp,編碼區(qū)全長1494bp,該片段是一個(gè)完整的基因,命名為pacA基因.該基因編碼的蛋白質(zhì)序列包含有23個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽和174個(gè)殘基組成的前肽序列.同源性分析表明,該基因序列與已經(jīng)報(bào)道的銅綠假單胞菌PA01菌株彈性蛋白酶lasB基因序列同源性99％,推導(dǎo)成熟肽氨基酸序列完全相同.將含有pacA全基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli