耐熱堿性蛋白酶產生菌株的分離鑒定及酶學性質研究.pdf

1、在河南商丘的鹽堿地堆肥土壤樣中分離到一株耐熱的產堿性蛋白酶菌株SR-15，經鑒定為枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)。該菌株經搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化，其產酶活力由370U/mL提高至1180U/mL，20升發(fā)酵試驗酶活達到1392U/mL。粗酶液經分離純化后，得到比活力為3315.9U/mg的純酶。 在鹽堿地堆肥土壤中取十五份土樣，用無菌水稀釋后涂布于酪蛋白底物培養(yǎng)基上，將產生透明圈的菌株挑出，在55℃條件下用酪蛋白底物

2、培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，獲得一株透明帶寬度最大的菌株SR-15。經形態(tài)學觀察、生理生化特性研究及全自動菌種鑒定儀鑒定，結果為枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)。 通過單因子和正交試驗獲得高產蛋白酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：玉米粉40g/L、黃豆粉40g/L、MgSO40.5g/L、NaCL10g/L、K2HPO41.0g/L，最適培養(yǎng)條件為起始pH值10.0、培養(yǎng)溫度45℃、搖瓶轉速190rpm、250mL三角瓶的裝液量10

3、0mL。20升發(fā)酵試驗，酶活達到1392U/mL，并且發(fā)酵時間縮短了8h。 發(fā)酵液經過硫酸銨鹽析、SephadexG-75凝膠柱層析純化，得到比活力為3315.9U/mg的純酶，SDS-PAGE電泳測得分子量約27kDa。酶學特性研究表明，該酶最適pH為10，最適反應溫度為60℃，在40℃～50℃范圍內酶的穩(wěn)定性最好，在pH9-10條件下酶穩(wěn)定性相對較高，Ca2+、Mg2+對酶活有較明顯促進作用，Ag+對酶活有較較強抑制作用。