模擬體液法制備殼聚糖-羥磷灰石組織工程支架與評(píng)估.pdf

1、目的：
　　應(yīng)用模擬體液（simulated body fluid，SBF）仿生礦化法制備羥磷灰石(hydroxyapatite,HA)-殼聚糖（chitosan,CHI）支架，并對(duì)支架的理化性能及自身的吸水性能、溶脹性能、降解性能進(jìn)行評(píng)估，探討礦化時(shí)間對(duì)支架結(jié)構(gòu)的影響，并將成骨誘導(dǎo)后的脂肪基質(zhì)干細(xì)胞接種到該支架上，通過(guò)觀察細(xì)胞的增殖分化情況驗(yàn)證該支架的細(xì)胞相容性，進(jìn)一步了解該支架對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　方法：
　　先

2、將殼聚糖粉末溶于2％乙酸溶液中，應(yīng)用冷凍干燥法制備殼聚糖支架， NaOH乙醇-水溶液除酸，多聚磷酸鈉交聯(lián)；將該支架應(yīng)用交替浸泡法進(jìn)行預(yù)鈣化，然后浸入模擬體液中進(jìn)行礦化，控制礦化時(shí)間分別為7d、14d、21 d，即為三組實(shí)驗(yàn)組，單純殼聚糖支架為對(duì)照組，檢測(cè)支架的大體形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、孔徑、孔隙率、物質(zhì)組成、官能團(tuán)組成、機(jī)械力學(xué)性能及吸水率、溶脹率、降解性能、熱力學(xué)性質(zhì)等屬性，再將經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)后的脂肪基質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived

3、 stem cells, ADSCs）接種到支架上，觀察細(xì)胞-支架復(fù)合物粘附性、進(jìn)行Live/Dead染色、免疫組織化學(xué)染色、茜素紅染色分析、定量分析細(xì)胞增殖量、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性，確定支架的細(xì)胞相容性。
　　結(jié)果：
　　1.殼聚糖支架在模擬體液中礦化14d時(shí)生成的礦化物形態(tài)與支架基質(zhì)復(fù)合良好，在支架的孔壁上會(huì)形成條索狀聚集樣礦化物，礦化21d時(shí)礦化物呈團(tuán)聚狀、具有雜質(zhì)碎片

4、r>　　2.礦化14 d，殼聚糖支架的礦化物分布均勻，在X射線衍射圖像中能觀察到31.79°、32.21°、32.90°三個(gè)HA特征峰，晶體組成符合HA特征。
　　3.當(dāng)?shù)V化時(shí)間不足（礦化7d）時(shí)，殼聚糖支架的復(fù)合礦化物為碳酸化的羥基磷灰石，當(dāng)?shù)V化時(shí)間足夠長(zhǎng)（礦化14d以上）時(shí)，該支架的復(fù)合礦化物為磷酸化的羥基磷灰石。
　　4.壓縮/拉伸彈性模量隨著礦化時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，在礦化21 d時(shí)其壓縮/拉伸彈性模量分別達(dá)到79Kpa

5、和86Kpa，與單純殼聚糖支架組（對(duì)照組）的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　5.當(dāng)支架在降解液中剛開(kāi)始降解時(shí)，其降解率升高的很快，隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，支架的降解率趨于穩(wěn)定。降解液的pH第一周內(nèi)上升，第二周內(nèi)下降，在隨后的時(shí)間內(nèi)緩慢上升直至穩(wěn)定在7.54。
　　6.礦化14d的細(xì)胞在掃面電子顯微鏡中相比于其他兩組其粘附性最強(qiáng)、Dead/Live染色中成活性最好、CCK-8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增殖量最多，與其他實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的差

6、異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　7.Ⅰ型膠原染色和茜素紅染色顯示三組實(shí)驗(yàn)組其細(xì)胞數(shù)量、Ⅰ型膠原及鈣離子分泌量隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，并且礦化14d組支架接種的細(xì)胞Ⅰ型膠原分泌情況最佳、鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量最多。
　　結(jié)論：
　　1.模擬體液仿生礦化法制備的支架在模擬體液中礦化14d時(shí)，其礦化物分布均勻，孔徑大小相較于其他組趨于一致，礦化物晶體組成符合具有生物活性的羥基磷灰石特征，其理化性質(zhì)達(dá)到最佳狀態(tài)。

7、　　2.隨著礦化時(shí)間的延長(zhǎng)，支架的吸水率增高、溶脹率降低，降解率和降解液的pH值趨于穩(wěn)定。
　　3.礦化14d組支架接種細(xì)胞后，其粘附性、成活性、堿性磷酸酶分泌活性良好；三組細(xì)胞數(shù)量、Ⅰ型膠原分泌量、鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量均隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，且達(dá)到本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的細(xì)胞培養(yǎng)21天時(shí)最佳；礦化14d組支架在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均相比于其他兩組為多，由此得出礦化14d組的細(xì)胞-支架復(fù)合物的相容性最強(qiáng)。
　　4.模擬體液仿生礦化法是一種新型的組