HEPIS基因功能的初步研究.pdf

1、目的：通過(guò)對(duì)人類睪丸組織高表達(dá)的四百多個(gè)未知功能基因進(jìn)行大規(guī)?；陔p熒光素酶活性檢測(cè)的信號(hào)通路篩選，發(fā)現(xiàn)了一批激活或抑制信號(hào)通路的陽(yáng)性基因，能夠顯著上調(diào)或下調(diào)內(nèi)參螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。從中選擇顯著抑制 NF-κB信號(hào)通路的基因HEPIS（Human embryo lung cellular protein interacting with SARS-CoV nsp-10，HEPIS）進(jìn)行功能研究。生物信息學(xué)分析HEPIS基因，初步了解其基

2、本理化性質(zhì)、對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并預(yù)測(cè)其功能；通過(guò)半定量-PCR研究HEPIS在不同組織的表達(dá)譜；預(yù)測(cè)和驗(yàn)證 HEPIS蛋白的亞細(xì)胞定位；分別構(gòu)建高效 HEPIS真核表達(dá)質(zhì)粒和siRNA沉默子，體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染腎細(xì)胞系293T和腎癌細(xì)胞系 A498，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)及功能的變化探討 HEPIS基因抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制，為開(kāi)發(fā)有重要生理活性及臨床應(yīng)用前景的新功能基因奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1、目的基因的篩選：分析海腎/螢火蟲(chóng)熒光素酶雙報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)

3、 NF-κB、CRE、Wnt和HRE四條通路大規(guī)模篩選的結(jié)果，選擇HEPIS為本次研究的目的基因。2、生物信息學(xué)分析：通過(guò)各種分析軟件和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析HEPIS基因的核酸及 HEPIS蛋白質(zhì)的序列組成、理化性質(zhì)、定位、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、物種同源性及二級(jí)結(jié)構(gòu)等。3、表達(dá)譜分析：利用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HEPIS基因的在多個(gè)細(xì)胞系中的表達(dá)譜，選取目的基因?qū)?xì)胞增殖影響研究的適合細(xì)胞系。4、真核表達(dá)質(zhì)粒的克隆構(gòu)建：利用分子

4、克隆技術(shù)將目的基因 HEPIS的CDS區(qū)插入到pCMVSPORT6、pEGFPC3、pEGFPN1的真核表達(dá)載體上。5、亞細(xì)胞定位：將 HEPIS-pEGFPN1和HEPIS-pEGFPC3分別轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察融合的綠色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)位置，推斷蛋白定位。6、使用引物設(shè)計(jì)軟件針對(duì)HEPIS的CDS區(qū)設(shè)計(jì)、合成并擴(kuò)增針對(duì)目的基因的siRNA片段，使之形成Hairpin siRNA結(jié)構(gòu)，有效沉默目的基因，并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

5、沉默與過(guò)表達(dá)的效率。7、功能實(shí)驗(yàn)：通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀察、克隆形成、劃痕實(shí)驗(yàn)、CCK8試劑盒檢測(cè)等來(lái)驗(yàn)證過(guò)表達(dá)和沉默HEPIS對(duì)腎細(xì)胞系293T以及腎癌細(xì)胞系A(chǔ)498增殖的影響。8、HEPIS抑制細(xì)胞增殖的機(jī)理：首先通過(guò)轉(zhuǎn)染使 HEK293T細(xì)胞過(guò)表達(dá)或沉默HEPIS，然后利用血清饑餓培養(yǎng)使細(xì)胞周期同步化，最后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，明確HEPIS影響細(xì)胞周期的途徑。
　　結(jié)果：1、篩選結(jié)果顯示 HEPIS顯著下調(diào) NF-κB的

6、活性。2、生物信息學(xué)分析顯示：HEPIS全長(zhǎng)666bp，CDS區(qū)444bp，可編碼出一個(gè)147個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，無(wú)信號(hào)肽，定位在細(xì)胞核，與其他物種同源性較低，是人類進(jìn)化較特異的基因。3 RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明 HEPIS廣泛表達(dá)于人類細(xì)胞系中。4、將 HEPIS-pEGFPN1和HEPIS-pEGFPC3分別轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察融合的綠色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)位置，結(jié)果表明其定位于胞質(zhì)。5、以空載 pCMVSPORT6

7、載體質(zhì)粒為對(duì)照，分別轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá) HEPIS基因的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染干擾 HEPIS基因表達(dá)的siRNA沉默子，通過(guò)在293T細(xì)胞系中24小時(shí)后觀察細(xì)胞形態(tài)和在A498細(xì)胞系中15天克隆形成計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn) HEPIS有抑制細(xì)胞增殖作用。6、在腎細(xì)胞系293T和腎癌細(xì)胞系 A498中，應(yīng)用 CCK8試劑盒連續(xù)檢測(cè)細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá) HEPIS組細(xì)胞增殖顯著下降，沉默 HEPIS組細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng)。7、轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞周期，分析得知過(guò)表達(dá)