尖孢鐮刀菌Qip基因功能初步研究.pdf

1、RNA沉默是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，幾乎存在于所有的真核生物中。RNA沉默途徑調(diào)控真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育，防御病毒入侵以及維持生物體基因組的穩(wěn)定。RNA沉默過(guò)程需要Argonaute，Dicer，RNA dependent RNA polymerase和Qip（QDE-2的互作蛋白）等的參與。甘藍(lán)枯萎病是在全世界范圍內(nèi)甘藍(lán)種植區(qū)都有發(fā)生的一種維管束土傳病害，對(duì)甘藍(lán)的生產(chǎn)造成極大危害，甘藍(lán)枯萎病病原菌為甘藍(lán)專(zhuān)化型尖孢鐮刀菌（Fusarium

2、oxysporum f. sp.conglutinans）。本文以甘藍(lán)專(zhuān)化型尖孢鐮刀菌生理小種1號(hào)A8為代表，通過(guò)基因敲除尖孢鐮刀菌中Qip基因，比較分析敲除突變株和野生型菌株的差異，研究Qip基因的功能。為枯萎病生理機(jī)制和致病機(jī)理的研究提供進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　1、基于12種不同專(zhuān)化型尖孢鐮刀菌基因組測(cè)序分析，我們用脈胞菌（N.crassa）中Qip(QDE-2)蛋白序列查找比對(duì)NCBI里12種不同專(zhuān)化型尖孢

3、鐮刀菌所有注釋蛋白，初步發(fā)現(xiàn)有一類(lèi)蛋白在12種不同專(zhuān)化型尖孢鐮刀菌中極其保守，且只有一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域DEDDh，距離N末端22-122個(gè)氨基酸殘基。DEDDh結(jié)構(gòu)域?qū)儆?’-5’核酸外切酶家族。MEGA6軟件比對(duì)12種尖孢鐮刀菌Qip蛋白序列，結(jié)果顯示，相似度達(dá)99％，都是由495個(gè)氨基酸殘基組成，只有15個(gè)氨基酸差異，說(shuō)明Qip蛋白在12種尖孢鐮刀菌中是保守的。同時(shí)對(duì)12種不同專(zhuān)化型尖孢鐮刀菌Qip基因進(jìn)行了克隆，說(shuō)明生物信息學(xué)預(yù)

4、測(cè)的可靠性。
　　2、提取甘藍(lán)專(zhuān)化型尖孢鐮刀菌的RNA，RT-PCR結(jié)果顯示Qip基因是表達(dá)的。我們用甘藍(lán)專(zhuān)化型尖孢鐮刀菌為材料進(jìn)行基因敲除，敲除原理是利用基因同源重組技術(shù)。我們?cè)趐KOV21載體中潮霉素基因的上下游分別進(jìn)行了兩次雙酶切對(duì)應(yīng)連接Qip基因序列的上下游側(cè)翼序列。制備甘藍(lán)專(zhuān)化型尖孢鐮刀菌的原生質(zhì)體，以備后面遺傳轉(zhuǎn)化使用。利用潮霉素抗性基因?yàn)檎蚝Y選標(biāo)記，新霉素抗性基因?yàn)樨?fù)向篩選標(biāo)記，首先篩選在含有潮霉素平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化

5、子，然后將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到含有新霉素的平板上進(jìn)行二次篩選（新霉素板上生長(zhǎng)受抑制）。突變株P(guān)CR驗(yàn)證結(jié)果顯示Qip目的基因已經(jīng)被敲除，Southern雜交結(jié)果顯示△Qip突變株中只發(fā)生一次同源重組事件。
　　3、Qip基因與菌絲生長(zhǎng)發(fā)育和致病力相關(guān)。突變體菌絲生長(zhǎng)速率較野生型要慢，菌絲分支也比野生型菌絲分支多，說(shuō)明Qip基因在菌絲的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)方面起重要的調(diào)控作用；對(duì)分生孢子的形態(tài)沒(méi)有影響;對(duì)甘藍(lán)的侵染結(jié)果表明，△Qip突變株對(duì)甘藍(lán)的致病力