人bit1基因功能的初步研究.pdf

1、bit1基因是2004年研究整合素對Bcl-2的表達(dá)調(diào)控時發(fā)現(xiàn)的一個新基因，因其具有下調(diào)Bcl-2表達(dá)的功能而命名為bit1(bcl-2inhibitoroftranscription1)。后來的基因組研究表明，從細(xì)菌到人類Bit1在進(jìn)化上是高度保守的。在人體組織內(nèi)，Bit1在睪丸、前列腺、骨骼肌及肝臟高表達(dá)，在心臟、脾、胎盤及結(jié)腸有表達(dá)，人胸腺及外周血白細(xì)胞中幾乎檢測不到它的表達(dá)。Bit1蛋白定位于線粒體內(nèi)膜；胞漿內(nèi)Bit1濃度的升高

2、可以明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而其濃度的降低可以減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。也就是說，Bit1蛋白是一種與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的新分子，因此，研究這種具有促凋亡作用的線粒體蛋白對于探索凋亡的發(fā)生和調(diào)節(jié)具有重要意義。本研究旨在觀察該蛋白在人婦科腫瘤細(xì)胞中的分布及生物學(xué)作用，并初步探討其作用機(jī)制，以期為婦科腫瘤的治療提供一些新的思路。 本課題研究可以分為以下三個部分： (一)應(yīng)用組織芯片技術(shù)分析Bit1在婦科腫瘤中的分布 方法：應(yīng)

3、用組織芯片技術(shù)，通過免疫組織化學(xué)方法比較84例宮頸癌標(biāo)本和76例正常宮頸組織標(biāo)本中Bit1的表達(dá)情況，以及82例卵巢癌標(biāo)本和78例正常卵巢組織標(biāo)本中Bit1的表達(dá)情況。 結(jié)果：經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Bit1在宮頸癌和正常宮頸組織中的表達(dá)無顯著性差異，在不同的宮頸癌病理分級中也無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異；而Bit1在卵巢癌組織中的表達(dá)卻顯著高于正常卵巢組織，并且隨著病理分級的增加，Bit1的表達(dá)水平顯著降低。鑒于這種差異表達(dá)，我們選取卵巢癌

4、作為研究模型。 (二)觀察人Bit1蛋白促卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用 方法：首先構(gòu)建pCMV-Myc-bit1和pCMV-Myc-EGFP真核表達(dá)載體，并利用RT-PCR和WesternBlot方法鑒定人卵巢癌細(xì)胞Caov-3中bit1基因的內(nèi)源性表達(dá)情況。然后應(yīng)用pCMV-Myc-EGFP表達(dá)載體優(yōu)化人卵巢癌細(xì)胞Caov-3的轉(zhuǎn)染條件，將含bit1基因的表達(dá)載體pCMV-Myc-bit1以最佳條件轉(zhuǎn)染Caov-3細(xì)胞。檢測轉(zhuǎn)

5、染后bit1基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)情況，并用MTT法檢測轉(zhuǎn)染bit1基因的Caov-3細(xì)胞的活力，通過熒光顯微鏡、瓊脂糖凝膠電泳法和流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染bit1基因的Caov-3細(xì)胞的凋亡。 結(jié)果：RT-PCR及WesternBlot檢測結(jié)果顯示人卵巢癌細(xì)胞Caov-3中僅有少量目的基因的表達(dá)。而Caov-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-bit1真核表達(dá)載體后，RT-PCR及WesternBlot檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞有明確的人bit1

6、基因表達(dá)。MTT檢測、吖啶橙染色觀察、DNALadder實驗和FACS分析結(jié)果均顯示Bit1具有促細(xì)胞凋亡的作用。此外，F(xiàn)ACS分析結(jié)果還表明：隨著培養(yǎng)時間的延長，pCMV-Myc-bit1轉(zhuǎn)染的Caov-3細(xì)胞，凋亡現(xiàn)象明顯增加，而未轉(zhuǎn)染的Caov-3細(xì)胞和pCMV-Myc轉(zhuǎn)染的Caov-3細(xì)胞在不同實驗培養(yǎng)時間內(nèi)，凋亡細(xì)胞極其少見。 (三)利用酵母雙雜交技術(shù)釣取人Bit1蛋白的結(jié)合蛋白 方法：將人bit1基因片段插入

7、表達(dá)載體pGBKT7，構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-bit1。用該載體轉(zhuǎn)染酵母感受態(tài)細(xì)胞后，分別檢測人bit1基因做為誘餌對報告基因HIS3、LacZ和MEL1的激活作用。大量制備MATCHMAKERGAL4cDNA文庫質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入含有pGBK-T7-bit1的AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞，測定共轉(zhuǎn)化效率，收集轉(zhuǎn)化子文庫。在三輪共轉(zhuǎn)化子的高嚴(yán)謹(jǐn)性篩選后，挑選依然呈藍(lán)色的部分，做β-半乳糖苷酶檢測，陽性克隆即為含有候選蛋白的克隆。對候選

8、陽性克隆進(jìn)行測序，初步獲得人Bit1結(jié)合蛋白的基因序列。最后在酵母細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步驗證所篩選的候選結(jié)合蛋白與Bit1之間的相互作用。 結(jié)果：構(gòu)建了用于酵母雙雜交的誘餌載體pGBKT7-bit1，并證明誘餌蛋白對酵母菌無毒性，對報告基因HIS3、LacZ和MEL1也沒有激活作用。將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入含質(zhì)粒pGBKT7-bit1的酵母宿主后，經(jīng)過層層篩選，從人bit1基因高表達(dá)的胎肝cDNA文庫中，篩選得到15個陽性克隆，分別

9、編碼4種蛋白。其中6個克隆與人的AES(Groucho家族成員)基因高度同源，6個克隆與人的AIF(Apoptosisinducingfactor,凋亡誘導(dǎo)因子)基因高度同源，2個克隆與組織蛋白酶D(cathepsinD)基因高度同源，1個克隆與NIT2(nitrilasefamily,member2)基因高度同源。其中AIF候選蛋白是一種在凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用的線粒體蛋白，所以我們把AIF蛋白做為重點研究對象，通過酵母雙雜交實驗、

10、哺乳動物細(xì)胞共轉(zhuǎn)染和免疫共沉淀法，在酵母細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步驗證了Bit1和AIF之間的相互作用。結(jié)果表明，Bit1蛋白的確可以和AIF蛋白發(fā)生相互作用。該結(jié)果為我們進(jìn)一步研究Bit1的功能機(jī)制提供了方向和線索。 綜上所述，本課題首先應(yīng)用組織芯片技術(shù)分析了人Bit1蛋白在宮頸癌和卵巢癌中的分布情況，并根據(jù)差異表達(dá)的現(xiàn)象選取卵巢癌作為研究模型；其次較全面的觀察到該蛋白促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞Caov-3凋亡的作用；最后通過酵母雙雜交