蠟梅Cpglp基因功能的初步研究.pdf

1、Germin-like proteins(GLPs)是由多基因家族編碼的一類與Germins結(jié)構(gòu)類似的糖蛋白，通常通過離子鍵結(jié)合，以穩(wěn)定的寡聚體形式存在于胞外基質(zhì)。GLPs廣泛存在于植物的各種器官、組織以及發(fā)育的各個階段，在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用，研究表明GLPS在植物細(xì)胞中以酶、結(jié)構(gòu)蛋白、受體的形式存在。從本實驗室構(gòu)建的蠟梅花混合cDNA文庫中，隨機挑選克隆子測序，獲得了全K的Germin-like protein基因，將其命

2、名Cpglp(GeneBank accession number：EU116342)。運用生物信息學(xué)手段對cDNA序列進(jìn)行了分析，并構(gòu)建了表達(dá)載體，通過對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了一批轉(zhuǎn)基因植株，并對該基因的功能進(jìn)行了初步分析。研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 1.Cpglp及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 利用DNAStar，ProtParam等軟件分析克隆基因的序列，分析表明該cDNA序列長922bp.其中ORF645bp，編碼214個

3、氨基酸，該蛋白質(zhì)的理論分子量為22.3kDa，等電點為6.08。在NCBI上進(jìn)行blastp比對。共有46條氨基酸序列與其有較高的同源性，排在第一位的是葡萄中的Germin。like protein蛋白質(zhì)，相似性達(dá)79％。 2.表達(dá)載體的構(gòu)建 Cpglp基因位于文庫克隆載體pTriplEx2上，活化菌液并用限制性內(nèi)切酶Sill酶切，同時酶切添加了Sill酶切位點的環(huán)狀pMD-18TM，回收目的片段和載體并連接，經(jīng)過酶切和

4、PCR驗證，成功構(gòu)建了克隆載體；再用Xbal和Smal分別雙酶切克隆載體和表達(dá)載體pC2301，回收目的片段和表達(dá)載體并連接，經(jīng)酶切和PCR驗證，成功構(gòu)建了含有目的基因的表達(dá)載體。 3.根瘤土壤桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和Km抗性煙草植株的獲得 采用根瘤十壤桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，將外源目的基因?qū)霟煵?，得到?8株Km+再生植株。 4.轉(zhuǎn)基因煙草的分子生物學(xué)鑒定 對具有Km+煙草的根系進(jìn)行GuS染色，其中有18株

5、煙草的根系被染上藍(lán)色，初步表明外源目的基因?qū)氩⒄系綗煵萑旧w基因組中。然后提取GUS染色呈陽性的植株的DNA進(jìn)行PCR檢測，電泳條帶顯示GUS染色呈陽性植株擴出一條與陽性對照相同的特異性條帶，而對照植株則在相同的位置無特異性條帶出現(xiàn)。提取5株轉(zhuǎn)基因煙草的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用目的基因的特異引物進(jìn)行擴增，電泳圖譜顯示出一條與目的基因片段大小一致的預(yù)期條帶，而對照則無特異性條帶出現(xiàn)，說明目的基岡能正常表達(dá)，能轉(zhuǎn)錄生成RNA。

6、5.轉(zhuǎn)基因煙草的生長素敏感性試驗 由于GLPs蛋白在植物細(xì)胞中可能作為生長素的受體而存在于胞外基質(zhì)。通過在NCBI上對目的基因編碼的蛋白質(zhì)與NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，CpGLP與桃樹GLP蛋白有較高的同源性(73％)，而桃樹GLP具有能與生長素結(jié)合的活性。取轉(zhuǎn)基岡煙草及對照葉片接種在附加1mg/L的6-BA，50mg/L的Km(對照外植體分化培養(yǎng)基中不添加)，及不同濃度NAA(0，0.1，0.2，0.3.0.4，0.5，0.

7、6 mg/L)的分化培養(yǎng)基上，其中每個NAA濃度處理的外植體數(shù)大約30個，在一個月后統(tǒng)計每個不同NAA濃度處理的16個外植體分化的不定芽數(shù)，并計算出轉(zhuǎn)基因與對照平均每個外植體分化的不定芽數(shù)目，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示Cpglp的編碼蛋白不具有生長素結(jié)合活性。 6.熱激轉(zhuǎn)基因煙草的鹽脅迫試驗 去掉轉(zhuǎn)基岡煙草6株和對照煙草6株根系的十壤，放入盛有自來水的培養(yǎng)瓶中。在人工氣候箱中45℃下熱處理5min后，將煙草轉(zhuǎn)入250mm01/L的