金柑屬種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及多倍體種質(zhì)創(chuàng)新研究.pdf

1、金柑屬(Fortunella Swingle)是蕓香科(Rutaceae)柑橘亞科(Aurantioideae)植物，共有6個(gè)種1個(gè)變種。金柑為栽培種類的統(tǒng)稱，一年可多次開(kāi)花結(jié)果。果實(shí)色艷形美，營(yíng)養(yǎng)豐富，有吉祥喜慶之寓意，是鮮食、加工和觀賞的多用型果樹(shù)。金柑屬所有種均原產(chǎn)我國(guó)，然而目前栽培的金柑品種較少，鮮食以金彈為主，品種單一，限制了產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
　　 為了更好的保護(hù)和創(chuàng)新利用金柑屬種質(zhì)資源，探索金柑多倍體育種的有效途徑

2、，本研究在調(diào)查、收集金柑種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，根據(jù)形態(tài)特征和SCoT分子標(biāo)記結(jié)果對(duì)其進(jìn)行了聚類分析，并觀察了陽(yáng)朔金柑、金棗、長(zhǎng)壽金柑和融安滑皮金柑等品種的雌雄配子發(fā)育過(guò)程、減數(shù)分裂行為、2n花粉自然發(fā)生率，確定誘導(dǎo)2n配子的適宜時(shí)期和方法；以不同秋水仙素濃度及處理時(shí)間對(duì)陽(yáng)朔金柑、金棗的花蕾進(jìn)行2n雌雄配子誘導(dǎo)，用誘導(dǎo)的2n雌雄配子與未處理的雌雄配子進(jìn)行雜交，同時(shí)，以種子為材料進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，并對(duì)新創(chuàng)造的四倍體陽(yáng)朔金柑新種質(zhì)進(jìn)行遺傳特性分析和

3、有性雜交。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、通過(guò)實(shí)地考察、通訊等方式調(diào)查并收集了國(guó)內(nèi)外金柑屬種質(zhì)資源42份，包括國(guó)內(nèi)栽培品種資源、國(guó)外引進(jìn)資源、野生資源和人工創(chuàng)造新種質(zhì)四種類型。
　　 2、對(duì)其中25份種質(zhì)資源進(jìn)行形態(tài)分類，結(jié)果顯示：在歐氏距離D=10.3處，25份資源Q型聚類能區(qū)分野生資源和栽培資源，并能按產(chǎn)品用途區(qū)分；在歐氏距離D=10.2處，23個(gè)主要性狀的R型聚類可分為3組，從聚類結(jié)果看，年開(kāi)花次數(shù)，花性，花瓣顏色，

4、花柱狀態(tài)，花著生狀態(tài)，花著生位置，花瓣數(shù)等8個(gè)性狀的歐氏距離一樣，說(shuō)明利用這些性狀來(lái)鑒別金柑種質(zhì)資源可靠性差；其余性狀均能分辨所屬類型，因此，選用這些性狀對(duì)金柑屬資源進(jìn)行遺傳多樣性分析是合理的。綜合形態(tài)觀察描述、Q型系統(tǒng)聚類及R型聚類分析結(jié)果，認(rèn)為金柑花的形態(tài)、開(kāi)花習(xí)性和成熟期等性狀差異不明顯，不宜作為金柑種質(zhì)資源分類的主要依據(jù)，但其果實(shí)形態(tài)和葉片形態(tài)可以作為種質(zhì)資源分類的主要標(biāo)志。
　　 3、采用SCoT分子標(biāo)記方法，對(duì)26份

5、金柑屬種質(zhì)資源進(jìn)行的分子分類結(jié)果表明：從76條引物中篩選出8條多態(tài)性好、擴(kuò)增清晰的引物，共擴(kuò)增出63條條帶，其中48條具有多態(tài)性，多態(tài)性帶比率為76.2%。UPGMA聚類分析結(jié)果顯示：26份金柑種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.67～1.00之間，在遺傳系數(shù)為0.68水平處將26份資源分成了兩大類，第1類包括越南金柑1～5號(hào)和四季桔共6份資源，第2類包括除第1類以外的金柑屬的所有資源；而在遺傳系數(shù)為0.85水平處將26份資源分成了6組。聚類結(jié)

6、果基本支持了形態(tài)學(xué)分類及ISSR的聚類結(jié)果，說(shuō)明SCoT分子標(biāo)記適用于金柑種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。
　　 4、根據(jù)形態(tài)分類和分子標(biāo)記結(jié)果，認(rèn)為中越邊境野生金柑資源(山桔)應(yīng)為金柑屬的新種類或變種，并提出了分類建議和詳細(xì)的性狀描述。這一結(jié)果國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。
　　 5、對(duì)金柑2n花粉的自然發(fā)生率進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)部分金柑品種有自然2n花粉存在，但比率很低，其中金棗的2n花粉自然發(fā)生率為0.42%，融安滑皮金柑的2n

7、花粉自然發(fā)生率為0.30%，陽(yáng)朔金柑和長(zhǎng)壽金柑沒(méi)有發(fā)現(xiàn)2n花粉，可見(jiàn)，自然2n花粉難滿足多倍體育種的需要，育種上的應(yīng)用需要進(jìn)行人工誘變。
　　 6、對(duì)花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程及其與2n雄配子誘導(dǎo)的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)金柑屬不同品種花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程基本一致，但各品種的分裂時(shí)期與其花蕾形態(tài)及大小的相關(guān)性卻隨著品種的不同而不同。金棗、陽(yáng)朔金柑、融安滑皮金柑及長(zhǎng)壽金柑的花蕾縱徑分別為0.197～0.271cm、0.200～0.28

8、0cm、0.203～0.270cm和0.206～0.269cm時(shí)，花蕾形態(tài)為近球形，白色，此時(shí)為花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂Ⅰ前期，是各品種誘導(dǎo)2n雄配子的最佳時(shí)期。
　　 7、對(duì)胚囊母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程及其與2n雌配子誘導(dǎo)的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同金柑品種雌配子發(fā)育過(guò)程及其與花蕾形態(tài)有密切相關(guān)性，不同品種在同一發(fā)育時(shí)期其花蕾縱徑大小不同，大孢子減數(shù)分裂Ⅰ前期時(shí)，金棗、陽(yáng)朔金柑、融安滑皮金柑及長(zhǎng)壽金柑的花蕾縱徑分別為：0.207～0.29

9、1cm、0.250～0.306cm、0.270～0.310cm和0.246～0.312cm，此時(shí)是誘導(dǎo)2n雌配子的最佳時(shí)期。
　　 8、對(duì)金柑雌雄配子發(fā)育時(shí)期進(jìn)行的觀察表明：雌雄配子發(fā)育過(guò)程不同步，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂Ⅰ前期早于胚囊母細(xì)胞減數(shù)分裂Ⅰ前期，這給2n雌雄配子誘導(dǎo)造成一定困難；花粉的開(kāi)始成熟期早于胚囊最早成熟期。
　　 9、用秋水仙素誘導(dǎo)2n雄配子的研究表明：0.10%、0.20%、0.25%和0.30%的秋水仙

10、素濃度和48h、72h和96h的處理時(shí)間組合分別處理金棗、陽(yáng)朔金柑和融安滑皮金柑花蕾均能產(chǎn)生一定比率的2n花粉；金棗、陽(yáng)朔金柑和融安滑皮金柑的最高2n花粉誘變率分別為4.69%、2.78%和3.06%；最佳秋水仙素濃度和處理時(shí)間組合分別為0.25%、72h，0.3%、72h和0.3%、96h。
　　 10、三倍體誘導(dǎo)的研究表明：以金棗、陽(yáng)朔金柑和融安滑皮金柑為母本(n雌配子)，分別用各品種2n花粉誘變率最高組合的花粉授粉，經(jīng)過(guò)對(duì)

11、種子根尖染色體檢測(cè)，所有種子染色體數(shù)均為18，未發(fā)現(xiàn)多倍體。以金棗2n雌配子誘導(dǎo)作母本與n雄配子雜交共獲得115個(gè)果，312粒種子，其中30%的果實(shí)無(wú)核。經(jīng)過(guò)對(duì)所有種子根尖染色體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)0.25%秋水仙素處理72h后作母本雜交和處理96h自交的種子各獲得1個(gè)染色體數(shù)為27的三倍體，2n雌配子誘變率分別為1.7%。陽(yáng)朔金柑2n雌配子誘導(dǎo)后雜交共獲得127個(gè)果，423粒種子，經(jīng)過(guò)對(duì)所有雜交種子根尖染色體檢測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多倍體種子。說(shuō)明利用2

12、n配子創(chuàng)造三倍體的效果受到品種的胚性、2n配子性別和胚早期敗育等因素的影響，其中，單胚品種的2n雌配子利用效果最好。
　　 11、四倍體誘導(dǎo)的研究表明，以不同秋水仙素濃度和處理時(shí)間誘導(dǎo)陽(yáng)朔金柑和金棗萌動(dòng)種子，結(jié)果顯示：不同處理組合均發(fā)生不同程度的變異，不同處理濃度的變異率不同，同一處理濃度不同的浸泡時(shí)間變異率的變化趨勢(shì)也不同，0.1%～0.2%較低濃度秋水仙素處理24h～48h的效果較好，各獲得1個(gè)四倍體變異，還有7個(gè)植株性狀變

13、異單株。
　　 12、對(duì)新創(chuàng)造的四倍體陽(yáng)朔金柑新種質(zhì)進(jìn)行的遺傳研究表明：四倍體陽(yáng)朔金柑染色體4X=36，為同質(zhì)量突變體；植株生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，葉片濃綠，葉緣波浪形皺褶，花蕾橫徑較大，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂粗線期觀察到雙核細(xì)胞，四分體時(shí)期出現(xiàn)二分體、三分體現(xiàn)象；花粉發(fā)芽率降低，花粉粒較大，花粉形態(tài)與其起源二倍體陽(yáng)朔金柑有明顯差異，但花瓣色澤，花瓣數(shù)，花器構(gòu)造，雄蕊數(shù)等性狀與二倍體陽(yáng)朔金柑無(wú)明顯差異；單位葉面積氣孔數(shù)顯著減少：第一批花現(xiàn)蕾期比

14、二倍體金柑的遲，果實(shí)橢圓形，果面油胞多且大，可溶性固形物16%～18%，平均種子數(shù)為0.9粒，多胚，果實(shí)性狀模糊評(píng)級(jí)達(dá)優(yōu)秀。綜合分析認(rèn)為，該四倍體陽(yáng)朔金柑除了可作三倍體育種親本外，經(jīng)選育，有望直接用于生產(chǎn)。從該四倍體金柑自花授粉實(shí)生后代獲得2個(gè)三倍體(3X=27)。此結(jié)果國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。
　　 13、以四倍體陽(yáng)朔金柑與二倍體金柑雜交，結(jié)果表明：所有雜交組合均能獲得雜種果實(shí)，金柑種間、種內(nèi)雜交均能親和，但坐果率和結(jié)籽率不高。坐果率