FTY-720P聯(lián)合同種異體骨治療骨缺損相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　1、通過骨缺損動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并通過影像學(xué)評(píng)分、骨密度檢查及組織學(xué)檢查以驗(yàn)證FTY-720P聯(lián)合同種異體骨治療骨缺損的效果，進(jìn)一步通過熒光定量PCR初步推測(cè)其可能的治療機(jī)制。
　　2、通過體外兩種方式的破骨細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)及破骨細(xì)胞吞噬骨片后骨陷窩計(jì)數(shù)的方式，分析FTY-720P對(duì)破骨細(xì)胞形成及其吞噬功能的影響，后通過蛋白芯片的方式，檢測(cè)應(yīng)用FTY-720P和無FTY-720P破骨細(xì)胞中蛋白表達(dá)差異，推測(cè)

2、其可能的機(jī)制，從而為下一步進(jìn)行組織工程學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、同種異體骨的制備:解剖完整取出新西蘭大白兔四肢長骨，采用深凍法去除其抗原性，將制備好異體骨真空包裝后，以25kGy鈷60輻照滅菌并置于4℃恒溫冰箱內(nèi)保存。
　　2、建模及分組:采用Girolamo等方法，選用成年新西蘭大白兔，體重在2.0kg～3.0kg范圍內(nèi)，性別不限，建立新西蘭大白兔脛骨單側(cè)皮質(zhì)缺損模型，然后進(jìn)行隨機(jī)分組，隨機(jī)抽取12只

3、為單純骨缺損組，12只為單純同種異體骨移植治療組，12只為單純自體骨移植對(duì)照組，12只為FTY-720P聯(lián)合同種異體骨治療組。
　　3、影像學(xué)檢查及Lane-Sandhu影像學(xué)評(píng)分:分別于術(shù)后2周，4周，8周，12周采用耳緣靜脈注射2％戊巴比妥鈉，按照1 ml/kg麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，效果滿意后首先進(jìn)行X線影像學(xué)檢查，并通過三名熟悉Lane-Sandhu影像學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行評(píng)分，并記錄結(jié)果。
　　4、骨密度檢測(cè):分別于術(shù)后

4、2周、4周、8周和12周，于各組中選取一只動(dòng)物，采用耳緣靜脈注射空氣的方法處死動(dòng)物后，于骨密度儀上測(cè)量骨缺損區(qū)的骨密度相對(duì)值。
　　5、組織標(biāo)本大體肉眼觀察及HE染色觀察:于術(shù)后2周、4周、8周和12周采用耳緣靜脈注射空氣法處死動(dòng)物，首先進(jìn)行脫鈣處理，效果滿意后進(jìn)行常規(guī)HE染色處理，并于光鏡下觀察標(biāo)本HE染色情況。
　　結(jié)果:
　　1、影像學(xué)檢查及Lane-Sandhu影像學(xué)評(píng)分
　　影像學(xué)檢查提示:自術(shù)后2周到

5、術(shù)后12周，除術(shù)后第2周組外，術(shù)后第4、8、12周組采用FTY-720P聯(lián)合同種異體骨治療骨缺損組骨愈合效果與單純采用自體骨組效果相當(dāng)，并優(yōu)于單純同種異體骨移植對(duì)照組和空白組。Lane-Sandhu影像學(xué)評(píng)分，采用結(jié)果提示:術(shù)后2周各組經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=0.257，P=0.854。因P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后4周各組經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=170.469，P＜0.001。采用SNK對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)間進(jìn)行兩兩比較，按α=0.05水準(zhǔn)

6、，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組(3.67±0.14)與自體骨移植對(duì)照組(3.97±0.17)評(píng)分高于同種異體骨移植對(duì)照組(3.07±0.26)，同種異體骨移植對(duì)照組(3.07±0.24)高于空白組(0.63±0.24)，但尚不能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組與自體骨移植對(duì)照組評(píng)分均數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.109)。術(shù)后8周各組經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=30.655，P＜0.001。采用SNK對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)間進(jìn)行兩兩比較，按α=0.05水準(zhǔn)，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組(5.73±0.77)、

7、單純自體骨移植對(duì)照組(6.16±0.34)及單純同種異體骨移植對(duì)照組(5.19±0.29)評(píng)分高于空白組(1.64±0.94)，但尚不能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組與兩組對(duì)照組評(píng)分均數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.218)。術(shù)后12周各組單因素方差分析，F(xiàn)=69.152，P＜0.001。采用SNK對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)間進(jìn)行兩兩比較，按α=0.05水準(zhǔn)，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組(7.93±0.57)、單純自體骨移植對(duì)照組(8.76±0.64)與單純同種異體骨移植對(duì)照組(6.99±0

8、.37)評(píng)分高于空白組(2.36±0.74)，且自體骨移植對(duì)照組(8.76±0.64)評(píng)分大于單純同種異體骨移植對(duì)照組(6.99±0.37)，但尚不能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組與自體骨移植對(duì)照組(P=0.126)、實(shí)驗(yàn)組與同種異體骨對(duì)照組(P=0.089)評(píng)分均數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、骨密度檢測(cè)
　　術(shù)后2周各組骨密度結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，F(xiàn)=98.359，P＜0.001。采用SNK對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)間進(jìn)行兩兩比較，按α=0.05水準(zhǔn)，可認(rèn)

9、為自體骨移植對(duì)照組(0.64±0.02)大于實(shí)驗(yàn)組(0.60±0.02)，實(shí)驗(yàn)組(0.60±0.02)大于單純同種異體骨對(duì)照組(0.47±0.02)，三組均大于空白組(0.40±0.02)。術(shù)后4周各組骨密度結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，F(xiàn)=13.370，P=0.002。采用SNK對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)間進(jìn)行兩兩比較，按α=0.05水準(zhǔn)，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組(1.24±0.03)、單純自體骨移植對(duì)照組(1.30±0.05)與單純同種異體骨移植對(duì)照組(1.19

10、±0.02)相對(duì)骨密度值高于空白組(1.00±0.10)，但尚不能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組與兩組對(duì)照組相對(duì)骨密度的均數(shù)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.138。術(shù)后8周各組骨密度結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，F(xiàn)=21.433，P＜0.001。采用SNK對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)間進(jìn)行兩兩比較，按α=0.05水準(zhǔn)，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組(1.35±0.05)、單純自體骨移植對(duì)照組(1.42±0.04)與單純同種異體骨移植對(duì)照組(1.30±0.02)相對(duì)骨密度值高于空白組(1.09±0.08

11、)，但尚不能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組與兩組對(duì)照組相對(duì)骨密度的均數(shù)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.066。術(shù)后12周各組骨密度結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，F(xiàn)=33.971，P＜0.001。采用SNK對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)間進(jìn)行兩兩比較，按α=0.05水準(zhǔn)，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組(1.51±0.07)、單純自體骨移植對(duì)照組(1.60±0.03)與單純同種異體骨移植對(duì)照組(1.50±0.04)相對(duì)骨密度值高于空白組(1.17±0.07)，但尚不能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組與兩組對(duì)照組相對(duì)骨密度的均數(shù)之

12、間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.148。
　　3、組織標(biāo)本大體肉眼觀察及HE染色觀察
　　術(shù)后2周各組均可見血性及炎癥細(xì)胞滲出，其中自體骨移植對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組炎癥滲出相對(duì)較其他兩組少，并可見移植骨殘留;術(shù)后4周，空白組炎癥細(xì)胞較前滲出增加，而其他各組炎癥細(xì)胞滲出均較前減少，同時(shí)仍舊可見移植骨殘留，移植骨周圍可見炎癥細(xì)胞圍繞;術(shù)后8周，各組中血性及炎癥細(xì)胞滲出較前明顯減少，各組均呈現(xiàn)出修復(fù)狀態(tài)，預(yù)實(shí)驗(yàn)組及自體骨移植對(duì)照組相比，同種異體骨移

13、植對(duì)照組可見其修復(fù)部位骨排列紊亂;術(shù)后12周，各組恢復(fù)情況不同，空白組可見于兩斷端部分主要以肉芽組織填充為主，而自體骨移植對(duì)照組恢復(fù)好，同種異體骨移植對(duì)照組仍舊骨小梁排列紊亂，實(shí)驗(yàn)組中仍舊可見少量同種異體骨殘留。
　　4、熒光定量PCR結(jié)果:
　　通過RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果提示術(shù)后2周，BMP-2和VEGF的表達(dá)均表現(xiàn)為單純同種異體骨移植對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大于自體骨移植對(duì)照組，而ColⅠα1的表達(dá)表現(xiàn)為自體骨移植對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大

14、于同種異體骨移植對(duì)照組，Spp-1、S1P受體表達(dá)三組之間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后4周，BMP-2、Spp-1和VEGF的表達(dá)表現(xiàn)為單純同種異體骨移植對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大于自體骨移植對(duì)照組，而ColⅠα1和S1P受體表達(dá)表現(xiàn)為三組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后8周，VEGF、ColⅠα1和S1P受體表達(dá)表現(xiàn)為自體骨移植對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大于單純同種異體骨對(duì)照組，而BMP-2和Spp-1的表達(dá)量三組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后12周，BMP-2表達(dá)表

15、現(xiàn)為單純同種異體骨對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量大于單純自體骨移植對(duì)照組，Spp-1和VEGF表達(dá)表現(xiàn)為三組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ColⅠα1與S1P受體表達(dá)表現(xiàn)為自體骨移植對(duì)照組表達(dá)量大于單純同種異體骨對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組。
　　5、RAW264.7誘導(dǎo)破骨細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變
　　形態(tài)學(xué)觀察:未加入RANKL刺激的RAW264.7細(xì)胞，可見細(xì)胞呈貼壁生長，并可見細(xì)胞老化形成梭形或不規(guī)則形狀，未見多核細(xì)胞;而加入RANKL刺激的RAW264.

16、7細(xì)胞，可見多核巨細(xì)胞生成，并可見細(xì)胞周圍有細(xì)小偽足形成。
　　結(jié)論：
　　1、通過影像學(xué)檢查、影像學(xué)評(píng)分、骨密度檢查及HE染色觀察結(jié)果提示同種異體骨復(fù)合FTY-720P能夠取得和自體骨移植相近的修復(fù)骨缺損的效果。
　　2、通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，并不能準(zhǔn)確闡明FTY720P聯(lián)合同種異體骨治療骨缺損的具體治療機(jī)制，僅能提示可能與BMP-2、VEGF和Spp-1表達(dá)有關(guān)，因此需要進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)闡明FTY720P具體作

17、用機(jī)制。
　　3、通過計(jì)數(shù)經(jīng)TRAP酶染色后破骨細(xì)胞陽性率的情況，明確了RAW264.7細(xì)胞最佳的誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的細(xì)胞代數(shù)及最佳的誘導(dǎo)其形成破骨細(xì)胞的RANKL濃度，并證明FTY-720P可以有效抑制RAW264.7誘導(dǎo)成為破骨細(xì)胞。
　　4、通過TRAP酶和F-actin染色由BMMs誘導(dǎo)破骨細(xì)胞及甲苯胺藍(lán)染色后計(jì)數(shù)由BMMs誘導(dǎo)成為破骨細(xì)胞后吞噬骨片的骨陷窩實(shí)驗(yàn)，證明FTY-720P可以降低由BMMs誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的數(shù)目及吞