砷元素的形態(tài)分析及其對(duì)赤子愛勝蚓(Eisenia fetida)的生態(tài)毒性研究.pdf

1、砷是廣泛存在于自然界的一種類金屬元素。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類行為對(duì)環(huán)境影響的加劇，礦山開發(fā)、污水灌溉、農(nóng)藥使用等導(dǎo)致排入環(huán)境中的砷污染物大量增加，造成十分嚴(yán)重的環(huán)境問題。砷元素所具有的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其能夠在環(huán)境中和生物體中以不同的形態(tài)存在，主要包括三價(jià)砷[As(Ⅲ)]、五價(jià)砷[As(Ⅴ)]、一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)等。由于不同的砷形態(tài)彼此之間毒性差異較大，傳統(tǒng)的僅通過測(cè)定環(huán)境樣品中的總砷進(jìn)行環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法缺乏科學(xué)性，

2、不能給出有關(guān)毒性的準(zhǔn)確信息，因此有必要建立能夠高效分離測(cè)定環(huán)境樣品中多種形態(tài)砷化合物的方法，并在此基礎(chǔ)上研究不同形態(tài)砷對(duì)生物的毒性特征和致毒機(jī)理。
　　土壤是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，同時(shí)也是排入環(huán)境中的砷污染物大量積累的環(huán)境介質(zhì)之一。土壤中不同形態(tài)的砷既可通過各種途徑進(jìn)入動(dòng)植物體內(nèi)，產(chǎn)生毒性效應(yīng)，亦可通過食物鏈傳遞，對(duì)人體健康造成威脅。傳統(tǒng)的土壤污染檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法沒有針對(duì)不同形態(tài)砷的生態(tài)毒性進(jìn)行區(qū)分，無法反映不同形態(tài)砷的真實(shí)生

3、態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。因此，有必要研究土壤主要形態(tài)砷對(duì)典型指示生物的生態(tài)毒性特征和致毒機(jī)理，從而為基于環(huán)境中不同形態(tài)砷的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，建立適于指示土壤不同形態(tài)砷水平的評(píng)價(jià)指標(biāo)體系和生物評(píng)價(jià)模式，以及實(shí)施區(qū)分砷形態(tài)的環(huán)境污染控制和管理提供科學(xué)依據(jù)。
　　本論文針對(duì)環(huán)境中存在的四種主要形態(tài)砷，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA，在前人研究的基礎(chǔ)上，分別以改進(jìn)提取測(cè)定技術(shù)和研究在線自動(dòng)測(cè)定技術(shù)為主要突破點(diǎn)，建立了兩種新的砷形態(tài)分析方法，分別為衍生

4、-超臨界流體萃取-氣相色譜法和氫化物發(fā)生-冷阱捕獲-原子吸收法(HG-CT-AAS)。前者實(shí)現(xiàn)了衍生-超臨界流體萃取(SFE)和衍生-氣相色譜法(GC)的結(jié)合，簡化了砷形態(tài)分析的操作步驟，提高了分析效率;后者在原有的HG-CT-AAS分析系統(tǒng)中，加入了自動(dòng)在線預(yù)還原裝置并進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了預(yù)還原過程與HG-CT-AAS的聯(lián)合自動(dòng)運(yùn)行分析。在此基礎(chǔ)上，以國家和國際標(biāo)準(zhǔn)推薦的赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)作為典型指示生物，研究了上述

5、四種形態(tài)砷的急性毒性和亞慢性毒性，以及在蚯蚓體內(nèi)的生物富集和轉(zhuǎn)化過程;通過測(cè)定分析蚯蚓體內(nèi)7種氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶、還原型谷胱甘肽、脂質(zhì)過氧化水平）、金屬硫蛋白(MTs)和溶酶體膜穩(wěn)定性(LMS)等分子水平和亞細(xì)胞水平生物標(biāo)志物的響應(yīng)特征，計(jì)算綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)(IBR)，以及與化學(xué)分析結(jié)果結(jié)合分析劑量-效應(yīng)關(guān)系，研究不同形態(tài)砷對(duì)赤子愛勝蚓的生態(tài)毒性特征

6、和致毒機(jī)理。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下。
　　(1)結(jié)合衍生-SFE技術(shù)和衍生-GC技術(shù)，建立了一種衍生-SFE與GC聯(lián)用的分析方法。該方法能夠在SFE過程中發(fā)生衍生反應(yīng)，得到樣品中不同形態(tài)砷的衍生物，后者可直接注入GC進(jìn)行分離測(cè)定，得到樣品中的無機(jī)砷、MMA和DMA含量。優(yōu)化了衍生-SFE萃取的各項(xiàng)參數(shù)，最佳萃取條件為:30Mpa，100℃，10min靜態(tài)萃取和25min動(dòng)態(tài)萃取，2.0mLmin-1超臨界CO2流速，加入5％(v/

7、v)甲醇作為超臨界流體的改性劑，并加入一定量含有TritonⅩ-100的表面活性劑;比較了巰基乙酸乙酯(TGE)和巰基乙酸甲酯(TGM)兩種衍生試劑的衍生效果，確定TGE作為衍生試劑時(shí)能夠得到較好的分析結(jié)果;在最優(yōu)條件下，無機(jī)砷、MMA和DMA的檢出限分別為1.2、0.3和0.15mgkg-1。該方法具有分析速度快、選擇性好、準(zhǔn)確度高、檢出限低等特點(diǎn)，能夠直接提取并檢測(cè)固體樣品中不同形態(tài)的砷，可效減少有機(jī)試劑的消耗和有害化學(xué)廢物的產(chǎn)生量

8、。
　　(2)探索優(yōu)化HG-CT-AAS方法進(jìn)行砷形態(tài)分析時(shí)的樣品預(yù)還原過程，實(shí)現(xiàn)了As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA的準(zhǔn)確定量分析。首先通過優(yōu)化傳統(tǒng)離線預(yù)還原方法所用的還原劑種類和濃度，證明1％（m/v）巰基乙酸(TGA)為還原劑時(shí)能在較短時(shí)間內(nèi)完成As(Ⅴ)的預(yù)還原過程;在此基礎(chǔ)上建立了一套在線預(yù)還原系統(tǒng)，與HG-CT-AAS的管路系統(tǒng)相連接。優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在線預(yù)還原系統(tǒng)中加裝空氣分隔裝置，可以有效保證還原反應(yīng)體系

9、中各組分濃度的穩(wěn)定性，從而保證還原效果和砷形態(tài)分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。利用優(yōu)化后的方法建立了四種形態(tài)砷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA的檢出限分別為152ngL-1、146ngL-1、65ngL-1、52ngL-1，實(shí)現(xiàn)了痕量水平的砷形態(tài)分析。該方法具有分析速度快、準(zhǔn)確度高、檢出限低等特點(diǎn)，并通過在線預(yù)還原過程實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化操作，既減少了人為操作的不確定性，同時(shí)也縮短了樣品分析時(shí)間，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。
　　(3)選

10、取土壤中的四種主要的形態(tài)砷，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA，以赤子愛勝蚓為指示生物，參照國家和國際標(biāo)準(zhǔn)方法展開四種形態(tài)砷對(duì)赤子愛勝蚓的急性毒性實(shí)驗(yàn)，得到As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA對(duì)赤子愛勝蚓的14dLC50值分別為293.3、352.4、3425.1和3730.3mgkg-1，大小排序與不同形態(tài)砷的毒性大小順序相一致。選擇四種形態(tài)砷14dLC50的十分之一，作為為期64天的亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)的暴露濃度，結(jié)果顯示暴露于無機(jī)

11、砷的蚯蚓生物個(gè)體出現(xiàn)明顯的生物富集現(xiàn)象，而暴露于有機(jī)砷的個(gè)體未發(fā)生生物富集。研究了不同形態(tài)砷在蚯蚓體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)砷轉(zhuǎn)化過程模型為，生物體將進(jìn)入體內(nèi)的砷由高毒性的無機(jī)砷逐步轉(zhuǎn)化為低毒性的有機(jī)砷，最終轉(zhuǎn)化為復(fù)雜的無毒砷化合物排出體外，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)砷的解毒和代謝。但研究中還發(fā)現(xiàn)了與上述過程相反的有機(jī)砷去甲基化的過程，導(dǎo)致生成了毒性較大的無機(jī)砷，逐漸積累并對(duì)生物體產(chǎn)生危害，這是MMA和DMA具有間接生物毒性的機(jī)制之一。
　

12、　(4)對(duì)赤子愛勝蚓展開為期64天的亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，測(cè)定了蚯蚓體內(nèi)的7種氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物和MTs的活性水平變化特征，發(fā)現(xiàn)暴露于As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的實(shí)驗(yàn)組的多種生物標(biāo)志物響應(yīng)趨勢(shì)彼此相似，而暴露于MMA和DMA的實(shí)驗(yàn)組的多種生物標(biāo)志物響應(yīng)趨勢(shì)也彼此相似;前者的生物標(biāo)志物變化幅度大于后者，無機(jī)砷污染對(duì)赤子愛勝蚓的生物毒性影響大于有機(jī)砷。實(shí)驗(yàn)后期，暴露于無機(jī)砷的生物個(gè)體逐漸出現(xiàn)了氧化損傷，As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的污染壓力逐漸超出了

13、抗氧化防御系統(tǒng)的調(diào)控能力;而暴露于有機(jī)砷的生物個(gè)體未出現(xiàn)氧化損傷，其抗氧化防御系統(tǒng)有效發(fā)揮了作用。應(yīng)用IBR指數(shù)將8種生物標(biāo)志物的響應(yīng)整合計(jì)算，四種形態(tài)砷的生物毒性大小排序?yàn)锳s(Ⅲ)＞As(Ⅴ)＞MMA和DMA，兩種有機(jī)砷彼此之間的毒性差異較小。在高濃度有機(jī)砷污染的實(shí)驗(yàn)組中，MMA和DMA的生物富集沒有引起生物標(biāo)志物的顯著變化，而MMA和DMA的去甲基化過程逐漸造成無機(jī)砷的積累，同時(shí)引起了蚯蚓的生物標(biāo)志物響應(yīng)，兩者之間具有很好的相關(guān)性

14、;在無機(jī)砷實(shí)驗(yàn)組中，生物標(biāo)志物變化趨勢(shì)也與體內(nèi)無機(jī)砷的變化趨勢(shì)相一致。研究發(fā)現(xiàn)砷的致毒機(jī)制為:無機(jī)砷可通過誘導(dǎo)生成氧化自由基(ROS)，破壞生物體內(nèi)的ROS平衡，對(duì)生物體產(chǎn)生氧化損傷毒性;有機(jī)砷可通過去甲基化生成無機(jī)砷，逐漸積累并按照與無機(jī)砷相同的途徑致毒。因此在環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)或生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中，應(yīng)當(dāng)區(qū)分環(huán)境中或生物體內(nèi)不同形態(tài)的砷，包括本身直接毒性較低的有機(jī)砷，以得到更為合理的環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果。
　　(5)選取土壤中的四種

15、主要的形態(tài)砷，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA，以赤子愛勝蚓為實(shí)驗(yàn)生物，測(cè)定為期70天的暴露實(shí)驗(yàn)周期中蚯蚓體內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性的變化特征，展開四種形態(tài)砷對(duì)赤子愛勝蚓的亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)蚯蚓體內(nèi)的不同形態(tài)砷和總砷進(jìn)行分析，得到的蚯蚓體內(nèi)不同形態(tài)砷的生物轉(zhuǎn)化規(guī)律與第四章的研究結(jié)論相同。四個(gè)實(shí)驗(yàn)組蚯蚓的溶酶體膜穩(wěn)定性隨著暴露實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行逐步下降，四種形態(tài)砷的毒性大小順序?yàn)锳s(Ⅲ)＞As(Ⅴ)＞MMA＞DMA。暴露于有機(jī)砷的蚯蚓體內(nèi)

16、大量富集MMA和DMA，同時(shí)未引起蚯蚓溶酶體膜的顯著響應(yīng);但隨著有機(jī)砷的去甲基化過程產(chǎn)生的無機(jī)砷不斷積累，逐漸造成生物體溶酶體膜損傷，顯示MMA和DMA具有間接毒性。中性紅保留時(shí)間(NRRT)作為蚯蚓溶酶體膜穩(wěn)定性的衡量指標(biāo)，與As(Ⅲ)和As(Ⅴ)均具有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，且與As(Ⅲ)的相關(guān)性大于As(Ⅴ)。生物體的溶酶體膜更易于受到As(Ⅲ)的毒性影響而降低穩(wěn)定性，這是As(Ⅲ)比As(Ⅴ)和有機(jī)砷具有更高生物毒性的機(jī)制之一。本