以形態(tài)分析為基礎(chǔ)的砷及砷生物代謝過(guò)程與產(chǎn)物的表征研究.pdf

1、本文以形態(tài)分析技術(shù)為主要研究手段，圍繞與生物砷代謝相關(guān)的三個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題包括中藥材，干海產(chǎn)品中砷的食用安全性、正常肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞代謝差異性以及砷生物代謝過(guò)程中砷蛋白的主要存在形態(tài)展開(kāi)研究，獲得了一系列有意義的結(jié)果及新認(rèn)識(shí)。主要研究?jī)?nèi)容及所得成果總結(jié)如下： 第一章，對(duì)國(guó)內(nèi)外在砷形態(tài)分析及砷生物代謝的近期研究及相關(guān)研究成果進(jìn)行了簡(jiǎn)單的介紹和評(píng)述，并在此基礎(chǔ)上歸納出與砷生物代謝相關(guān)的三個(gè)砷的“矛盾”特性；確定了本研究論文的研究重點(diǎn)及主要

2、研究?jī)?nèi)容。 第二章，建立了三價(jià)無(wú)機(jī)砷(AsⅢ)、五價(jià)無(wú)機(jī)砷(AsⅤ)、二甲基砷酸(DMA)、一甲基砷酸(MMA)、砷甜菜堿(AsB)和砷膽堿(AsC)六種形態(tài)砷的分離方法，采用梯度洗脫法使六種不同形態(tài)砷在15min內(nèi)得到較好分離。并用鹽酸浸提和超聲溶劑提取兩種前處理方法對(duì)中藥材中不同形態(tài)砷進(jìn)行提取，建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行中藥材中砷形態(tài)分析的方法，并用于6種中藥材中砷形態(tài)的分

3、析。研究發(fā)現(xiàn)中藥材中砷主要以無(wú)機(jī)砷AsⅤ和AsⅢ形態(tài)存在，此外動(dòng)物性藥材中還存在微量的砷甜菜堿(AsB)。 第三章，根據(jù)干海產(chǎn)品中不同形態(tài)砷的性質(zhì)不同，采用不同提取劑，建立了丙酮-甲醇-稀鹽酸連續(xù)提取的方法，并對(duì)該方法所采用的各種試劑進(jìn)行了優(yōu)化。 研究顯示該提取方法對(duì)干海產(chǎn)品中的各種形態(tài)砷具有較高的提取效率，三步總提取效率可達(dá)87-115％。在此基礎(chǔ)上對(duì)不同性質(zhì)的干海產(chǎn)品中的砷代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析，并采用高效液相色譜-電噴

4、霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-TOF-MS)對(duì)未知砷代謝產(chǎn)物進(jìn)行了表征。 結(jié)果顯示，盡管干海產(chǎn)品中含砷量較高，但在動(dòng)物性干海產(chǎn)品中砷主要以無(wú)毒的砷甜菜堿(AsB)形式存在，約占總可提取砷量的62.0-72.7％；而在植物性干海產(chǎn)品中砷主要以毒性較低的砷糖類物質(zhì)存在，約占總可提取砷量的63.5-92.7％。因此可以推斷干海產(chǎn)品的總體毒性較低。 第四章，在對(duì)比了多種消解方法的基礎(chǔ)上，建立了微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(Mic

5、rowave digestion-ICP-MS)測(cè)定細(xì)胞中砷總量的分析方法。 此外，本研究還建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行正常人體肝細(xì)胞(Chang肝細(xì)胞)中砷形態(tài)的分析方法。研究發(fā)現(xiàn)Chang肝細(xì)胞中存在兩種無(wú)法用已有商業(yè)化的砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)表征的砷形態(tài)。 本工作通過(guò)化學(xué)合成法制備了這兩種砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)，并采用標(biāo)準(zhǔn)加入法確定出該兩種未知砷形態(tài)分別為一甲基亞砷酸(MMAⅢ)和一甲基一

6、硫代砷酸(MMTA)。通過(guò)對(duì)正常肝細(xì)胞(Chang肝細(xì)胞)和肝癌細(xì)胞(QGY-7703肝癌細(xì)胞)砷代謝產(chǎn)物的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞對(duì)砷的代謝能力較弱。 此外，由于在肝癌細(xì)胞中未檢測(cè)到二甲基砷酸(DMAV)和一甲基一硫代砷酸(MMTA)，因而可推測(cè)這兩種代謝產(chǎn)物的缺失與肝癌細(xì)胞受到抑制有關(guān)，并在此研究基礎(chǔ)上根據(jù)砷甲基化代謝的機(jī)理推測(cè)了肝癌細(xì)胞受到抑制的原因。 第五章，采用組分分析法將染砷小鼠肝臟按其不同的物理化學(xué)特性分為多個(gè)組

7、分分別加以分析。結(jié)果顯示小鼠肝臟中砷主要以自由態(tài)存在，占總砷含量的42.3-72.8％。其次為砷與不可溶蛋白結(jié)合態(tài)，占總砷含量的18.4-33.4％。砷與可溶性蛋白結(jié)合態(tài)含量最少，占總砷含量的8.8-24.3％。此外，研究發(fā)現(xiàn)多種砷代謝產(chǎn)物均可與小鼠肝臟中的蛋白結(jié)合，其中又以二甲基砷-蛋白結(jié)合態(tài)的含量最高。 通過(guò)對(duì)三價(jià)砷化物(AsⅢ、MMAⅢ和DMAⅢ)與五價(jià)砷化物(AsⅤ、MMAⅤ和DMAⅤ)與小鼠肝臟蛋白的親和力強(qiáng)弱關(guān)系的對(duì)

8、比，發(fā)現(xiàn)三價(jià)砷化物與蛋白的親和力約為五價(jià)砷蛋白結(jié)合率的2倍，結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終確定出小鼠肝臟內(nèi)的砷蛋白主要以二甲基亞砷酸與蛋白結(jié)合物(DMAⅢ-protein)形態(tài)存在。 此外，本研究還發(fā)現(xiàn)一(二)硫代砷化物(MMTA，DMDTA)是砷代謝過(guò)程中較易出現(xiàn)的代謝產(chǎn)物，而且這類物質(zhì)是以與其對(duì)應(yīng)的一(二)甲基亞砷酸(MMAⅢ，DMAⅢ)為代謝起點(diǎn)。 本文以形態(tài)分析技術(shù)為主要研究手段，較系統(tǒng)地探討了干海產(chǎn)品和中藥材中砷及其化合