以形態(tài)分析為基礎(chǔ)的砷及砷生物代謝過程與產(chǎn)物的表征研究.pdf

1、本文以形態(tài)分析技術(shù)為主要研究手段，圍繞與生物砷代謝相關(guān)的三個熱點問題包括中藥材，干海產(chǎn)品中砷的食用安全性、正常肝細胞與肝癌細胞代謝差異性以及砷生物代謝過程中砷蛋白的主要存在形態(tài)展開研究，獲得了一系列有意義的結(jié)果及新認識。主要研究內(nèi)容及所得成果總結(jié)如下： 第一章，對國內(nèi)外在砷形態(tài)分析及砷生物代謝的近期研究及相關(guān)研究成果進行了簡單的介紹和評述，并在此基礎(chǔ)上歸納出與砷生物代謝相關(guān)的三個砷的“矛盾”特性；確定了本研究論文的研究重點及主要

2、研究內(nèi)容。 第二章，建立了三價無機砷(AsⅢ)、五價無機砷(AsⅤ)、二甲基砷酸(DMA)、一甲基砷酸(MMA)、砷甜菜堿(AsB)和砷膽堿(AsC)六種形態(tài)砷的分離方法，采用梯度洗脫法使六種不同形態(tài)砷在15min內(nèi)得到較好分離。并用鹽酸浸提和超聲溶劑提取兩種前處理方法對中藥材中不同形態(tài)砷進行提取，建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)進行中藥材中砷形態(tài)分析的方法，并用于6種中藥材中砷形態(tài)的分

3、析。研究發(fā)現(xiàn)中藥材中砷主要以無機砷AsⅤ和AsⅢ形態(tài)存在，此外動物性藥材中還存在微量的砷甜菜堿(AsB)。 第三章，根據(jù)干海產(chǎn)品中不同形態(tài)砷的性質(zhì)不同，采用不同提取劑，建立了丙酮-甲醇-稀鹽酸連續(xù)提取的方法，并對該方法所采用的各種試劑進行了優(yōu)化。 研究顯示該提取方法對干海產(chǎn)品中的各種形態(tài)砷具有較高的提取效率，三步總提取效率可達87-115％。在此基礎(chǔ)上對不同性質(zhì)的干海產(chǎn)品中的砷代謝產(chǎn)物進行了分析，并采用高效液相色譜-電噴

4、霧飛行時間質(zhì)譜(HPLC-TOF-MS)對未知砷代謝產(chǎn)物進行了表征。 結(jié)果顯示，盡管干海產(chǎn)品中含砷量較高，但在動物性干海產(chǎn)品中砷主要以無毒的砷甜菜堿(AsB)形式存在，約占總可提取砷量的62.0-72.7％；而在植物性干海產(chǎn)品中砷主要以毒性較低的砷糖類物質(zhì)存在，約占總可提取砷量的63.5-92.7％。因此可以推斷干海產(chǎn)品的總體毒性較低。 第四章，在對比了多種消解方法的基礎(chǔ)上，建立了微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(Mic

5、rowave digestion-ICP-MS)測定細胞中砷總量的分析方法。 此外，本研究還建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)進行正常人體肝細胞(Chang肝細胞)中砷形態(tài)的分析方法。研究發(fā)現(xiàn)Chang肝細胞中存在兩種無法用已有商業(yè)化的砷形態(tài)標準表征的砷形態(tài)。 本工作通過化學(xué)合成法制備了這兩種砷形態(tài)標準，并采用標準加入法確定出該兩種未知砷形態(tài)分別為一甲基亞砷酸(MMAⅢ)和一甲基一

6、硫代砷酸(MMTA)。通過對正常肝細胞(Chang肝細胞)和肝癌細胞(QGY-7703肝癌細胞)砷代謝產(chǎn)物的對比發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞對砷的代謝能力較弱。 此外，由于在肝癌細胞中未檢測到二甲基砷酸(DMAV)和一甲基一硫代砷酸(MMTA)，因而可推測這兩種代謝產(chǎn)物的缺失與肝癌細胞受到抑制有關(guān)，并在此研究基礎(chǔ)上根據(jù)砷甲基化代謝的機理推測了肝癌細胞受到抑制的原因。 第五章，采用組分分析法將染砷小鼠肝臟按其不同的物理化學(xué)特性分為多個組

7、分分別加以分析。結(jié)果顯示小鼠肝臟中砷主要以自由態(tài)存在，占總砷含量的42.3-72.8％。其次為砷與不可溶蛋白結(jié)合態(tài)，占總砷含量的18.4-33.4％。砷與可溶性蛋白結(jié)合態(tài)含量最少，占總砷含量的8.8-24.3％。此外，研究發(fā)現(xiàn)多種砷代謝產(chǎn)物均可與小鼠肝臟中的蛋白結(jié)合，其中又以二甲基砷-蛋白結(jié)合態(tài)的含量最高。 通過對三價砷化物(AsⅢ、MMAⅢ和DMAⅢ)與五價砷化物(AsⅤ、MMAⅤ和DMAⅤ)與小鼠肝臟蛋白的親和力強弱關(guān)系的對

8、比，發(fā)現(xiàn)三價砷化物與蛋白的親和力約為五價砷蛋白結(jié)合率的2倍，結(jié)合體內(nèi)實驗結(jié)果最終確定出小鼠肝臟內(nèi)的砷蛋白主要以二甲基亞砷酸與蛋白結(jié)合物(DMAⅢ-protein)形態(tài)存在。 此外，本研究還發(fā)現(xiàn)一(二)硫代砷化物(MMTA，DMDTA)是砷代謝過程中較易出現(xiàn)的代謝產(chǎn)物，而且這類物質(zhì)是以與其對應(yīng)的一(二)甲基亞砷酸(MMAⅢ，DMAⅢ)為代謝起點。 本文以形態(tài)分析技術(shù)為主要研究手段，較系統(tǒng)地探討了干海產(chǎn)品和中藥材中砷及其化合