Twist基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其在奧沙利鉑、氟尿嘧啶耐藥中的作用研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，結(jié)直腸癌的發(fā)病率居第3位，病死率居第4位，其5年生存率為50～60％[1]。在我國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位，病死率居第5位[2]。隨著社會(huì)進(jìn)步和生活改善，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率正呈明顯的上升趨勢(shì)。因此，對(duì)結(jié)直腸癌患者尋找有效的早診斷、早治療手段就迫在眉睫。
　　目前，化療是針對(duì)結(jié)直腸癌綜合治療重要手段之一，臨床上由奧

2、沙利鉑(oxaliplatin，OXA)、氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)與亞葉酸鈣組成的FOLFOX4方案已廣泛用于結(jié)直腸癌的治療，并有明顯療效[3]。但是，臨床上化療療效不理想的現(xiàn)象也是常見(jiàn)的，晚期階段的結(jié)直腸癌對(duì)目前的化療藥物反應(yīng)差并且預(yù)后極差，目前已認(rèn)識(shí)到相同TNM分期的患者也具有不同的預(yù)后和對(duì)治療的反應(yīng)[4]。引起化療療效不理想的原因很多，可能主要是:機(jī)體對(duì)化療藥敏感性差甚至排斥、腫瘤本身對(duì)化療藥物抵抗、腫瘤

3、對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性(multidrugresistance，MDR)等，其中多藥耐藥是主要原因，這也是目前人們關(guān)注熱點(diǎn)之一。
　　Twist基因是一種高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎形態(tài)發(fā)生中起關(guān)鍵調(diào)控作用，廣泛參與調(diào)控器官生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖分化等過(guò)程。宮奇林[6]等檢測(cè)112例結(jié)直腸癌組織及40例正常腸黏膜組織中Twist的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在11

4、2例結(jié)直腸癌組織中，Twist基因陽(yáng)性表達(dá)78例(69.6％)，正常組織中為15例(17.5％)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Twist在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)與腫瘤的分化程度、腫瘤浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。Twist的高表達(dá)往往提示結(jié)直腸癌預(yù)后差、易發(fā)生轉(zhuǎn)移。
　　同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)Twist基因在多種腫瘤細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)，在抗細(xì)胞凋亡、腫瘤的多藥耐藥性、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition，

5、EMT)、血管的發(fā)生和腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等方面起到了非常重要的作用[7，8]。Meng DW研究發(fā)現(xiàn)Twistl表達(dá)下調(diào)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)鼻咽癌對(duì)紫杉醇藥物的敏感性，提示Twistl是鼻咽癌治療的一個(gè)靶基因[9]。Cheng等研究指出，在乳腺癌細(xì)胞中，Twist表達(dá)上調(diào)，癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲和對(duì)紫杉醇的耐藥性明顯增加。由于Twist上調(diào)了Akt2，乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)紫杉醇的耐藥，同時(shí)增強(qiáng)了癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[10]。由此可見(jiàn)，Twist在

6、多藥耐藥方面起著重要的調(diào)控作用，但具體機(jī)制還不是很清楚。
　　Twist基因與腫瘤耐藥之間的關(guān)系是目前的研究熱點(diǎn)，既往的研究發(fā)現(xiàn)Twist可以通過(guò)不同的作用途徑調(diào)控化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。但Twist基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑、氟尿嘧啶耐藥中是否發(fā)揮著作用目前尚無(wú)研究報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究Twist基因與結(jié)直腸癌生物學(xué)特性以及發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，及探討Twist基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞奧沙利鉑、氟尿嘧啶耐藥中的作用，從而尋找到結(jié)直

7、腸癌新的治療靶點(diǎn)，增強(qiáng)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的殺傷作用，為臨床診斷和治療提供幫助。
　　目的：
　　1、研究Twist基因與結(jié)直腸癌生物學(xué)特性以及發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系及與結(jié)直腸癌患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系。
　　2、探討Twist基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞奧沙利鉑、氟尿嘧啶耐藥中的作用。
　　方法：
　　第一部分 Twist基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響
　　應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)95例有完整臨床病理資料和隨訪記錄的

8、結(jié)直腸癌患者的石蠟切片，觀察各組織中Twist的表達(dá)情況，分析其表達(dá)和臨床病理特征之間的關(guān)系，并進(jìn)行生存分析及Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析。
　　第二部分 Twist基因在結(jié)直腸癌奧沙利鉑、氟尿嘧啶耐藥中的作用研究
　　1、應(yīng)用免疫熒光、RT-PCR、Western blot分別檢測(cè)SW480、HCT116、Lovo細(xì)胞Twist mRNA及蛋白水平的表達(dá)。利用Twist過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、Twist-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染三株細(xì)胞，分別

9、使三株細(xì)胞中Twist基因高表達(dá)或低表達(dá)，利用RT-PCR、Western blot檢測(cè)其轉(zhuǎn)染情況。
　　2、應(yīng)用MTT法檢測(cè)不同濃度的奧沙利鉑及氟尿嘧啶在不同時(shí)間對(duì)結(jié)直腸癌SW480、HCT116、Lovo細(xì)胞增殖的影響。在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的奧沙利鉑和氟尿嘧啶溶液，避光條件下分別作用24、48、72、96h，在每個(gè)終止時(shí)間點(diǎn)用MTT法分別檢測(cè)奧沙利鉑和氟尿嘧啶對(duì)三株細(xì)胞增殖的影響，篩選出奧沙利鉑和氟尿嘧啶分別對(duì)細(xì)胞在S

10、W480、HCT116、Lovo細(xì)胞48h的半抑制濃度(IC50)。用濃度為IC5048h奧沙利鉑與IC5048h氟尿嘧啶（體積比例=1∶1），對(duì)經(jīng)不同處理后的三株細(xì)胞作用48h后，檢測(cè)Twist基因?qū)?xì)胞增殖的影響。
　　3、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用濃度為IC5048h奧沙利鉑與IC5048h氟尿嘧啶（體積比例=1∶1），對(duì)經(jīng)不同處理后的三株細(xì)胞作用48h后，Twist基因?qū)?xì)胞的凋亡率的影響。各細(xì)胞經(jīng)干擾、過(guò)表達(dá)處理后，按5×10

11、6/皿接種于150mm培養(yǎng)皿中，按處理分組及給藥辦法將藥物加入各實(shí)驗(yàn)組中，在終止時(shí)間點(diǎn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)每組的凋亡率。
　　結(jié)果：
　　第一部分 Twist基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響
　　Twist蛋白的表達(dá)位于組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，以細(xì)胞質(zhì)為主。結(jié)直腸癌組織中Twist蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于相應(yīng)正常結(jié)直腸黏膜組織，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=6.623，P＜0.01）。結(jié)直腸癌組織中Twist蛋

12、白的表達(dá)在結(jié)直腸癌患者的腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、復(fù)發(fā)等方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而在患者性別、年齡、腫瘤部位等方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示與Twist表達(dá)陰性的患者術(shù)后生存率明顯高于Twist表達(dá)陽(yáng)性患者（Log-rank檢驗(yàn)x2=35.189，P＜0.001）。經(jīng)單因素分析顯示，腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、T

13、wist蛋白表達(dá)是結(jié)直腸癌病人術(shù)后生存率的危險(xiǎn)因子。經(jīng)多因素分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Twist蛋白表達(dá)是病人術(shù)后死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。
　　第二部分 Twist基因在結(jié)直腸癌奧沙利鉑、氟尿嘧啶耐藥中的作用研究
　　1、免疫熒光、RT-PCR、Western blot結(jié)果顯示HCT116、Lovo細(xì)胞中Twist基因的表達(dá)分別與SW480細(xì)胞相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Twist mRNA在高轉(zhuǎn)移HCT116、Lovo

14、細(xì)胞株中的表達(dá)量顯著高于SW480，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Twist mRNA在Lovo細(xì)胞株中的表達(dá)量顯著高于HCT116，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在SW480、HCT116、Lovo細(xì)胞中，干擾組TwistmRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);過(guò)表達(dá)組TwistmRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。陰性對(duì)照組、干擾對(duì)照組、過(guò)表達(dá)對(duì)照組組間中細(xì)胞的Twi

15、st mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而Western blot結(jié)果提示Twist蛋白的表達(dá)情況與Twist mRNA的表達(dá)情況一致。
　　2、MTT法結(jié)果顯示:奧沙利鉑、氟尿嘧啶均對(duì)SW480、HCT116、Lovo細(xì)胞抑制作用隨著濃度升高和作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，呈劑量、時(shí)間依賴性;奧沙利鉑對(duì)SW480、HCT116、Lovo細(xì)胞48h半抑制濃度IC5048h分別為0.66μg/ml、11.86μg/ml、5

16、.75μg/ml;氟尿嘧啶對(duì)SW480、HCT116、Lovo細(xì)胞48h半抑制濃度IC5048h為94.83μg/ml、1.84μg/ml、27.66μg/ml:在濃度為IC5048h氟尿嘧啶與IC5048h奧沙利鉑聯(lián)合作用于不同處理后的SW480、HCT116、Lovo細(xì)胞48h后，干擾組細(xì)胞抑制率顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.05)，而過(guò)表達(dá)組細(xì)胞抑制率顯著低于陰性對(duì)照組(P＜0.05)。
　　3、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:在濃度IC

17、5048h氟尿嘧啶與IC5048h奧沙利鉑聯(lián)合作用于經(jīng)不同處理后的SW480、HCT116、Lovo細(xì)胞48h后，SW480、HCT116、Lovo細(xì)胞中不同處理組的早期、晚期及總凋亡率的組間差異比較均有顯著性差異(P＜0.05);干擾組細(xì)胞的早期、晚期及總凋亡率顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.05);過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的早期、晚期及總凋亡率顯著低于陰性對(duì)照組(P＜0.05);在同處理下，SW480、HCT116、Lovo細(xì)胞總凋亡率的組間差異比