Scinderin基因在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的相關(guān)功能研究.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文Scinderin基因在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的相關(guān)功能研究姓名：吳海福申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：姚禮慶20100406博士論文Scinderin基因在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的相關(guān)功能研究6將包裝好的慢病毒感染人結(jié)腸癌SW480和DLD1細(xì)胞，qPCR和Westernblot結(jié)果顯示SCIN敲降后兩種細(xì)胞中SCIN的表達(dá)得到明顯抑制。選取上述兩株細(xì)胞進(jìn)行MTT和Transwell功能實驗。結(jié)果：1VshRNA片段與

2、載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，每個片段均挑取5個克隆進(jìn)行PCR鑒定，連接入vshRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為343bp(從載體中切掉24bp)；沒有連接入vshRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為306bp，連接入載體的vshRNA基因片段大小為79bp，與設(shè)計的干擾序列長度一致。24對不同序列的siRNASCIN基因慢病毒表達(dá)載體DNA測序結(jié)果證實：PSCSll7621，PSCSll7622，PSCSll763，PSCSll76

3、4，PSCSll765載體均有一段與SCIN基因siRNA模板核苷酸相同，說明我們已經(jīng)將合成的雙鏈DNAoligo插入到vshRNA載體中，成功構(gòu)建了RNA干擾慢病毒載體。3PCR獲得SCIN基因片段，PCR產(chǎn)物酶切后大小：1412bp。PCR擴(kuò)增SCIN功能基因片段及酶切后電泳條帶片段大小與理論值一致，認(rèn)為獲得了SCIN基因片段。PCR酶切產(chǎn)物與酶切真核表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，PCR產(chǎn)物大小740bp。獲得的陽性克隆送測序，重組

4、的SCIN基因過表達(dá)載體測序與目標(biāo)基因序列完全一致，說明我們已將合成的SCIN基因插入到真核表達(dá)載體中，成功構(gòu)建了SCIN基因過表達(dá)載體。4從WesternBlot結(jié)果可以看出，KD3siRNA靶點(diǎn)對SCIN基因的表達(dá)有顯著的敲減作用，因而是有效靶點(diǎn)，其靶序列為CCGGCAC(認(rèn)GATGAGCTGACAACA朋盯CAAGAGMTGTTGTCAGCTCATCTCGTGnTrrG。選擇該靶點(diǎn)shRNA載體進(jìn)行慢病毒包裝。病毒滴度達(dá)2109T