NDRG2基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)、功能和作用機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)在世界范圍內(nèi)是最常見的惡性腫瘤之一。目前對CRC的主要治療手段是通過外科手術(shù)切除原發(fā)腫瘤，并且輔以新輔助化療、輔助化療和放射治療。盡管近年來醫(yī)學(xué)界在CRC的早期診斷、根治術(shù)式、放射治療和輔助化療方面取得了一定的進(jìn)展，但CRC的發(fā)病率和死亡率在近二十年來仍呈逐年上升的趨勢，而且TNM分期Ⅲ期和IV期的CRC病例的術(shù)后五年生存率仍較低。在CRC導(dǎo)致死亡的病例中，腫瘤進(jìn)展導(dǎo)致的侵襲轉(zhuǎn)移和術(shù)

2、后復(fù)發(fā)是致死的主要原因。因此，明確CRC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對CRC的預(yù)后診斷、個體化治療以及靶向治療具有重要的理論和實(shí)際意義。N-myc downstream-regulated gene（NDRG）家族由NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4四個具備57％-65％氨基酸同源性的成員組成。其中的NDRG2基因是由我校生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室首先克隆得到并報道的新基因。前期的研究發(fā)現(xiàn)NDRG2作為癌基因Myc的下游調(diào)節(jié)基因，在多

3、種人類惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中呈低表達(dá)，說明該基因極其有可能作為一個重要的抑癌基因參與腫瘤惡性生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)。但是NDRG2在CRC中的表達(dá)模式、具體的細(xì)胞水平和分子水平功能以及相關(guān)的作用機(jī)制迄今為止仍未闡明。
　　本研究為了闡明以上問題：
　　1．首先利用RT-PCR初步檢測了30例隨機(jī)選取的臨床CRC組織和配對正常組織中的NDRG2mRNA表達(dá)水平。
　　2．使用R

4、ealtime PCR檢測了226例臨床CRC組織和配對正常組織中的NDRG2mRNA表達(dá)水平，并使用統(tǒng)計學(xué)方法分析NDRG2mRNA表達(dá)與臨床病理資料以及病例預(yù)后的關(guān)系。
　　3．使用western blot檢測了86例隨機(jī)選取的臨床CRC組織和配對正常組織中的NDRG2蛋白表達(dá)水平。
　　4．使用西京醫(yī)院收集的260例臨床CRC標(biāo)本和天津市人民醫(yī)院收集的681例臨床CRC標(biāo)本制成組織芯片，并收集詳細(xì)的臨床病理資料和預(yù)后隨

5、訪資料。對組織芯片進(jìn)行NDRG2免疫組織化學(xué)染色和結(jié)果判讀，使用統(tǒng)計學(xué)方法分析大樣本中NDRG2蛋白表達(dá)與臨床病理資料和病例預(yù)后的關(guān)系。
　　5．使用脂質(zhì)體分別將pcDNA3.1-NDRG2和siRNA-NDRG2轉(zhuǎn)染入SW620細(xì)胞內(nèi)，使用Realtime PCR鑒定NDRG2mRNA水平的表達(dá)改變，使用western blot檢測NDRG2蛋白水平的表達(dá)改變。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為pcDNA3.1-NDRG2組、siRNA-NDRG2

6、組、空白對照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞）和空載體對照組（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的SW620細(xì)胞）。使用MTT比色法和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測SW620細(xì)胞的生長情況，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的周期和凋亡，使用transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力，使用裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。
　　6．使用免疫組織化學(xué)染色方法分析CRC組織芯片中NF-κB通路主要信號分子p65的表達(dá)情況，并使用統(tǒng)計學(xué)方法分析臨床標(biāo)本中NDR

7、G2與p65表達(dá)之間的關(guān)系。使用Realtime PCR和western blot方法檢測SW620細(xì)胞分別染入pcDNA3.1-NDRG2、siRNA-NDRG2后p65的表達(dá)情況。
　　以上的研究發(fā)現(xiàn)：
　　1．在使用RT-PCR檢測的30例臨床CRC組織和配對正常組織中，有12例CRC的NDRG2mRNA表達(dá)量較配對正常組織相比降低50％以上，說明NDRG2mRNA表達(dá)水平在CRC中有降低的趨勢。
　　2．使用R

8、ealtimePCR檢測的所有226例臨床CRC組織和配對正常組織中，統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NDRG2mRNA的表達(dá)水平在CRC組織中明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。而且NDRG2mRNA的表達(dá)水平與CRC的分化程度（P＜0.001）以及TNM分期密切相關(guān)（P＜0.001）。
　　3．在使用western blot檢測的86例臨床CRC組織和配對正常組織中，有52例CRC的NDRG2蛋白表達(dá)水平明顯低于配對正常組織，趨勢與

9、mRNA水平檢測結(jié)果一致。
　　4．在使用免疫組織化學(xué)染色方法檢測的組織芯片中，統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CRC標(biāo)本中的NDRG2蛋白表達(dá)水平與配對正常組織相比明顯降低（P＜0.001）。而且NDRG2蛋白表達(dá)水平與CRC的分化程度（P＜0.001）以及TNM分期密切相關(guān)（P＜0.001）。單因素和多因素生存分析發(fā)現(xiàn)NDRG2蛋白表達(dá)水平可以作為CRC的獨(dú)立預(yù)后影響因素。
　　5．Realtime PCR和western blot證實(shí)了

10、將pcDNA3.1-NDRG2和siRNA-NDRG2轉(zhuǎn)染入SW620細(xì)胞后，NDRG2mRNA和蛋白水平會分別升高和降低。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細(xì)胞生長明顯加快而pcDNA3.1-NDRG2組細(xì)胞生長則受到明顯抑制。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細(xì)胞克隆形成數(shù)量明顯增加而pcDNA3.1-NDRG2組細(xì)胞克隆形成數(shù)量則明顯減少。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-NDRG2組

11、細(xì)胞發(fā)生了明顯的G1期阻滯。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細(xì)胞凋亡明顯減少而pcDNA3.1-NDRG2組細(xì)胞凋亡則明顯增加。transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)而pcDNA3.1-NDRG2組細(xì)胞侵襲能力則明顯減弱。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siRNA-NDRG2組SW620細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力明顯增強(qiáng)而pcDNA3.1-NDRG2組細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力明顯下

12、降。
　　6．免疫組織化學(xué)染色方法分析CRC組織芯片中NDRG2和NF-κB通路主要信號分子p65的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)NDRG2與p65的蛋白表達(dá)水平在臨床CRC標(biāo)本中呈負(fù)相關(guān)。RealtimePCR和westernblot方法檢測發(fā)現(xiàn)SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NDRG2后p65的表達(dá)水平降低，而轉(zhuǎn)入siRNA-NDRG2后SW620細(xì)胞中p65的表達(dá)則上升。
　　以上的研究結(jié)果證明NDRG2的表達(dá)水平在CRC中呈下調(diào)表