天藍(lán)色鏈霉菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)的功能研究.pdf

1、第一部分：天藍(lán)色鏈霉菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)SC05403/5404缺失株的構(gòu)建及其功能的初步研究 在對天藍(lán)色鏈霉菌(S.coelicolor)雙組分調(diào)控系統(tǒng)(TCS)生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，選擇了與具有重要功能TCS同源性較高的9組作為研究對象。運(yùn)用PCR-targeting技術(shù)對這些TCS基因進(jìn)行了缺失，通過觀察突變體在固體培養(yǎng)基上(R2YE和MM)的形態(tài)分化及抗生素合成等表觀變化來推斷缺失TCS的可能功能。我們發(fā)現(xiàn)其中有一組TCS

2、(SC05403/5404)的缺失可引起突變體的抗生素Act產(chǎn)量明顯下降。為了進(jìn)一步研究SC05403/5404的功能，本實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用雙向凝膠電泳及MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對突變體與原始株M145的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，與M145相比，突變體中SC05477基因編碼的寡肽結(jié)合脂蛋白及SC06282編碼的3-oxoacyl-[acyl-carrier protein]reductase的蛋白量明顯下降。寡肽結(jié)合脂蛋白能夠介導(dǎo)細(xì)

3、菌寡肽的特異性攝入，這些寡肽可以作為次生代謝產(chǎn)物生物合成的前體，如Act生物合成所需的側(cè)鏈氨基酸，Val、Leu及Ile等。3-oxoacyl-[acyl-carrierprotein]reductase來源于一種I型聚酮類合成酶復(fù)合體(編碼基因?yàn)镾C06273～SC06288)，該酶復(fù)合體參與S.coelicolor中一種目前尚未鑒定的I型聚酮類次生代謝產(chǎn)物的生物合成。綜上所述，我們認(rèn)為SC05403/5404可能通過調(diào)控寡肽結(jié)合脂蛋

4、白的表達(dá)來有效控制細(xì)菌寡肽的攝入，從而參與S.coelicolor抗生素Act及其它次生代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控。 第二部分：天藍(lán)色鏈霉菌中對孤立應(yīng)答調(diào)控蛋白SC03818進(jìn)行活性調(diào)節(jié)的激酶的初步鑒定 根據(jù)John Innes centre的天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)數(shù)據(jù)庫http：∥streptomyces-org.uk／中關(guān)于雙組分調(diào)控系統(tǒng)SC00203／0204中RR S

5、C00204的注解，我們發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與孤立的RR SC03818同源性可達(dá)64.7％；另外，SC03818編碼基因附近沒有匹配的HK基因存在，因此，我們推測這兩個(gè)RR的活性司．能由同一HK SC00203調(diào)節(jié)。本文在表達(dá)純化SC00203、SC00204及SC03818三個(gè)蛋白的基礎(chǔ)上，通過體外磷酸化試驗(yàn)對上述推斷進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在Mg<'2+>或Mn<'2+>及[Y一<'32>P]ATP存在的條件下，HK SC00203夠發(fā)