天藍(lán)色鏈霉菌cvnA、sarA及rrdA基因功能的初步研究.pdf

1、第一部分
　　 天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)全基因組序列于2002年完成,在其中發(fā)現(xiàn)了13個(gè)非常保守的操縱子——conservon(cvn)。Cvn由4-5個(gè)基因組成(cvnABCD或者cvnABCDE),cvnA和cvnD分別編碼一個(gè)跟組氨酸激酶具有較弱相似性的膜蛋白和一個(gè)類(lèi)似真核G蛋白的GTP水解酶。我們?cè)谔焖{(lán)色鏈霉菌M145中成功構(gòu)建了分別缺失13個(gè)cvnA基因的突變體,并在YBP培養(yǎng)基(添加了不同小分子營(yíng)養(yǎng)物)上觀察它們的表型

2、變化,發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)cvnA基因的缺失影響了菌絲發(fā)育和次生代謝。cvnA1突變體比野生型菌株發(fā)育更快,產(chǎn)孢更豐富,隨著培養(yǎng)基內(nèi)滲透壓的升高,表型差異越來(lái)越明顯。相對(duì)于野生型來(lái)說(shuō),cvnA1突變體放線(xiàn)紫紅素(Act)和十一烷基靈菌紅素(Red)的產(chǎn)量增加。在固體培養(yǎng)基YBP上,添加0.2M或更高濃度的NaCl、NaNO3、KCl或者KNO3后,cvnA1突變體能大量產(chǎn)生Act。
　　 cvnA2突變體在含甘氨酸的YBP培養(yǎng)基上生長(zhǎng)發(fā)

3、育比野生型要好。cvnA8突變體在含谷氨酰胺的培養(yǎng)基上產(chǎn)Act比野生型要早。生化實(shí)驗(yàn)證明CvnA1蛋白沒(méi)有自磷酸化活性,但能結(jié)合并水解ATP。通過(guò)遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)CvnA1蛋白C端614個(gè)氨基酸對(duì)于上面所提到的表型不是必需的。進(jìn)一步的RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cvnA1突變體中ramR、ramC、chpE、bldN、redD和redZ的轉(zhuǎn)錄水平比野生型顯著升高了。這些結(jié)果表明CvnA1蛋白通過(guò)調(diào)控表面活化分子SapB、Chplins以及抗

4、生素合成通路轉(zhuǎn)錄活化因子的mRNA水平來(lái)調(diào)控氣生菌絲發(fā)育和次生代謝。
　　 第二部
　　 鏈霉菌在整個(gè)生活周期中會(huì)經(jīng)歷一個(gè)形態(tài)分化和次生代謝的復(fù)雜過(guò)程。我們?cè)谔焖{(lán)色鏈霉菌M145中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在鏈霉菌中高度保守的新基因sarA(sco4069,_sporulationandantibioticproductionrelatedgene),該基因編碼的蛋白除了跨膜結(jié)構(gòu)域外沒(méi)有任何已知功能結(jié)構(gòu)域。跟野生型相比,sarA突變體孢

5、子發(fā)育變快,Act和Red產(chǎn)量顯著降低。RT-PCR分析表明SarA通過(guò)調(diào)控actⅡ-orf4和redZ的mRNA水平來(lái)調(diào)控抗生素的合成。
　　 第三部分
　　 鏈霉菌除了具有復(fù)雜的形態(tài)分化外,還能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物特別是抗生素。為了能更深入地了解Red合成的信號(hào)調(diào)控通路,我們利用一種體內(nèi)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在天藍(lán)色鏈霉菌中尋找參與Red合成調(diào)控的新基因。我們一共得到了25個(gè)不能產(chǎn)生Red的突變體,這些突變體Act的產(chǎn)量也同時(shí)受到

6、了不同程度的影響。其中24個(gè)突變體的插入位點(diǎn)位于已知的Red生物合成基因簇中,另外一個(gè)突變體的插入位點(diǎn)位于rrdA(_regulatorof_red_D,sco1104)基因上游40bp。rrdA基因編碼一個(gè)TetR家族的轉(zhuǎn)錄因子蛋白,在鏈霉菌中高度保守。與野生型相比,rrdA突變株中Red產(chǎn)量提高,Act產(chǎn)量下降,而在過(guò)表達(dá)rrdA基因的M145菌株中Red的產(chǎn)生受到抑制,Act的產(chǎn)量得到提高。RT-PCR結(jié)果表明RrdA通過(guò)調(diào)控re