天藍(lán)色鏈霉菌cvnA、sarA及rrdA基因功能的初步研究.pdf

1、第一部分
　　 天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)全基因組序列于2002年完成,在其中發(fā)現(xiàn)了13個非常保守的操縱子——conservon(cvn)。Cvn由4-5個基因組成(cvnABCD或者cvnABCDE),cvnA和cvnD分別編碼一個跟組氨酸激酶具有較弱相似性的膜蛋白和一個類似真核G蛋白的GTP水解酶。我們在天藍(lán)色鏈霉菌M145中成功構(gòu)建了分別缺失13個cvnA基因的突變體,并在YBP培養(yǎng)基(添加了不同小分子營養(yǎng)物)上觀察它們的表型

2、變化,發(fā)現(xiàn)其中3個cvnA基因的缺失影響了菌絲發(fā)育和次生代謝。cvnA1突變體比野生型菌株發(fā)育更快,產(chǎn)孢更豐富,隨著培養(yǎng)基內(nèi)滲透壓的升高,表型差異越來越明顯。相對于野生型來說,cvnA1突變體放線紫紅素(Act)和十一烷基靈菌紅素(Red)的產(chǎn)量增加。在固體培養(yǎng)基YBP上,添加0.2M或更高濃度的NaCl、NaNO3、KCl或者KNO3后,cvnA1突變體能大量產(chǎn)生Act。
　　 cvnA2突變體在含甘氨酸的YBP培養(yǎng)基上生長發(fā)

3、育比野生型要好。cvnA8突變體在含谷氨酰胺的培養(yǎng)基上產(chǎn)Act比野生型要早。生化實(shí)驗證明CvnA1蛋白沒有自磷酸化活性,但能結(jié)合并水解ATP。通過遺傳互補(bǔ)實(shí)驗我們發(fā)現(xiàn)CvnA1蛋白C端614個氨基酸對于上面所提到的表型不是必需的。進(jìn)一步的RT-PCR實(shí)驗發(fā)現(xiàn)cvnA1突變體中ramR、ramC、chpE、bldN、redD和redZ的轉(zhuǎn)錄水平比野生型顯著升高了。這些結(jié)果表明CvnA1蛋白通過調(diào)控表面活化分子SapB、Chplins以及抗

4、生素合成通路轉(zhuǎn)錄活化因子的mRNA水平來調(diào)控氣生菌絲發(fā)育和次生代謝。
　　 第二部
　　 鏈霉菌在整個生活周期中會經(jīng)歷一個形態(tài)分化和次生代謝的復(fù)雜過程。我們在天藍(lán)色鏈霉菌M145中發(fā)現(xiàn)了一個在鏈霉菌中高度保守的新基因sarA(sco4069,_sporulationandantibioticproductionrelatedgene),該基因編碼的蛋白除了跨膜結(jié)構(gòu)域外沒有任何已知功能結(jié)構(gòu)域。跟野生型相比,sarA突變體孢

5、子發(fā)育變快,Act和Red產(chǎn)量顯著降低。RT-PCR分析表明SarA通過調(diào)控actⅡ-orf4和redZ的mRNA水平來調(diào)控抗生素的合成。
　　 第三部分
　　 鏈霉菌除了具有復(fù)雜的形態(tài)分化外,還能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物特別是抗生素。為了能更深入地了解Red合成的信號調(diào)控通路,我們利用一種體內(nèi)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在天藍(lán)色鏈霉菌中尋找參與Red合成調(diào)控的新基因。我們一共得到了25個不能產(chǎn)生Red的突變體,這些突變體Act的產(chǎn)量也同時受到

6、了不同程度的影響。其中24個突變體的插入位點(diǎn)位于已知的Red生物合成基因簇中,另外一個突變體的插入位點(diǎn)位于rrdA(_regulatorof_red_D,sco1104)基因上游40bp。rrdA基因編碼一個TetR家族的轉(zhuǎn)錄因子蛋白,在鏈霉菌中高度保守。與野生型相比,rrdA突變株中Red產(chǎn)量提高,Act產(chǎn)量下降,而在過表達(dá)rrdA基因的M145菌株中Red的產(chǎn)生受到抑制,Act的產(chǎn)量得到提高。RT-PCR結(jié)果表明RrdA通過調(diào)控re