釀酒酵母Bdf1p轉錄因子在高鹽脅迫反應中調控機制的研究.pdf

1、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最簡單和最早完成全基因組測序的真核生物(http：//genome-www.stanford.edu/Saccharomyces)。釀酒酵母易培養(yǎng)、生活周期短，遺傳背景清晰，同時以釀酒酵母為基礎的分子生物學研究技術平臺日趨完善，很容易制備各種突變體等遺傳學研究材料，使研究方便可行，是理想的真核生物模式種。 高鹽環(huán)境一直是人們關注的重要的脅迫因子之一，以釀酒酵母為模型開

2、展鹽脅迫機理研究，在國際上一直是生物學研究的熱點之一。目前，對釀酒酵母脅迫反應機制已經有了較深入的了解，高鹽脅迫對酵母細胞的毒害作用包括兩個方面，一是Na-離子毒害；二是產生滲透壓脅迫，使質膜的跨膜滲透壓降低而導致細胞膨脹壓的喪失。同時，一些重要的鹽脅迫信號傳導途徑和離子通道蛋白相繼被發(fā)現(xiàn)。例如：在高濃度NaCl條件下，高滲透性甘油促分裂原激酶信號轉導途徑(high osmolarity glycerol mitogen activat

3、ed protein kinase signaling transduction pathway，HOG-MAPK)通過促進甘油積累抵抗?jié)B透脅迫刺激。鈣調磷酸酶(Calcineurin，CaN)信號途徑通過轉錄因子Crz1p/Tcn1p激活酵母細胞ENAI(編碼重要P-型ATPase離子外排泵)的表達，促進Na+外排。同時TRK1/2p負責的K+/Na+離子吸收系統(tǒng)，通過提高K+離子親和性，優(yōu)先積累K+限制Na+的吸收，減少對細胞的毒害

4、作用Na-。本課題組前期利用轉座標簽隨機插入突變技術，首次在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)Bdflp(Bromodomain Transcription Factor 1)轉錄因子與高鹽脅迫有關。 BDF1基因的缺失并不會引起致死效應，屬于非基礎性的基因轉錄調控因子。Bdf1p轉錄因子在蛋白質結構上包含：2個“溴”結構域(Bromodomain)和一個位于C末端的ET(Extra-terminal)結構域，屬于BET轉錄因子家族。Bromodomain

5、結構域是近10年來發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于多種真核生物中的組蛋白賴氨酸乙?；稽c結合結構域，由60～110個高度保守的氨基酸殘基組成，目前對于含Bromodomain結構域蛋白功能的研究還處于起步階段。 本研究利用基因敲除(gene knockout)和化學藥物阻斷的方法，對鹽脅迫條件下HOG-MAPK途徑、Calcineurin途徑、ENA1基因、以及TRK1基因與BDF1基因之間的遺傳學關系進行了分析。實驗結果表明，當BDF1基因分

6、別與HOG1、CMP1CMP2、ENA1和TRK1基因同時缺失或阻斷時，酵母細胞的鹽耐受性均進一步減弱，該結果提示BDF1基因在酵母鹽脅迫應答反應中與上述途徑/基因可能分別涉及不同的酵母鹽脅迫途徑。 基因表達譜分析技術為酵母鹽脅迫反應分子機制及其相關基因功能的研究提供了全新和有效的研究手段。利用酵母全基因組芯片分別繪制了鹽脅迫條件下野生型菌株和bdflΔ菌株的基因表達譜，分析比較相互間的不同，在全基因范圍內尋找受Bdf1p影響的

7、鹽脅迫反應相關基因。野生型菌株和bdf1Δ菌株細胞經0.6 M NaCI處理45 min后，提取酵母總RNA，合成cDNA并分別用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP標記，與含有5935個開放閱讀框(open reading frame，ORF)的酵母全基因組芯片進行雜交并掃描。采用GenePix Pro 4.0圖像分析軟件(AxonInstruments公司)對芯片圖像進行分析，計算ratio值(兩種熒光強度的比值cy5/cy3)；然后

8、對芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進行歸一化；最后用T-test和以兩倍差異(即ratio值大于等于2.0，小于等于0.5)的標準來確定差異表達基因。為了消除熒光偏向性帶來的假陽性，鹽處理和對照的酵母細胞RNA樣品在反轉錄過程中進行熒光交換實驗，同時對于每個菌株鹽處理(W303鹽處理_/W303和bdf1Δ鹽處理/bdf1Δ)，都作兩次獨立的生物學重復實驗，分析兩次獨立實驗中表達變化趨勢一樣的基因，基因變化的數(shù)值取兩組數(shù)據(jù)的平均值。在此基

9、礎上，隨機挑選差異表達的基因，利用實時熒光定量RT-PCR(real-time quantitativeRT-PCR，qPCR)進行驗證，實驗結果顯示對所測定的基因與基因芯片技術檢測結果一致，不僅變化方向一致，而且表達值非常接近，說明芯片結果具有良好的準確性。本實驗共篩選出差異表達基因217個，有144個差異表達基因分別在野生型菌株與bdf1Δ菌株呈現(xiàn)相同的變化趨勢(上調基因119個，下調基因25個)。采用MIPS數(shù)據(jù)庫的在線軟件Fun

10、ctional Catalogue Database(http：//mips.gif.de/proj/funcatDB/search＿main＿fra me.html)進行生物學功能分類對上述144個差異表達基因進行功能分類發(fā)現(xiàn)，以上差異表達基因主要集中在甘油代謝、海藻糖代謝、離子通道蛋白、氧化脅迫反應、熱休克蛋白和功能未知蛋白等方面。其中ENA1基因在野生型菌株和bdf1Δ菌株中的鹽脅迫誘導表達倍數(shù)相似(5.25和6.32)，說明BD

11、F1基因缺失并未對鹽脅迫條件下ENA1基因的正常表達產生影響，與前面遺傳學分析結果一致，即BDF1和ENA1基因分別涉及不同酵母鹽脅迫途徑。同時，基因芯片數(shù)據(jù)顯示甘油合成關鍵酶基因GPD1(編碼3-磷酸甘油脫氫酶)，經鹽脅迫處理后，在野生型菌株和bdf1Δ菌株的基因表達水平均顯著上升，其誘導表達倍數(shù)分別高達35.79和35.52倍。酵母胞內甘油含量測定結果表明，經0.6M NaCl處理45 min后，野生型菌株和bdf1Δ菌株中甘油積累

12、均有大幅提高且含量相近，此結果與上述通過基因芯片在轉錄水平上測定結果一致。 BDF2是釀酒酵母BDF1基因的同源基因，采用長臂同源多聚酶鏈式反應(LFH-PCR)方法制備含有遺傳霉素耐藥基因(kanMX4)的BDF2基因敲除片段并轉化酵母，構建了bdf2Δ菌株。梯度生長實驗表明，與野生型菌株相比，BDF2基因缺失并不造成鹽敏感表型，說明BDF2基因是酵母鹽抗性的非必須基因?；蛐酒Y果顯示，BDF1基因缺失導致鹽脅迫條件下BDF

13、2基因表達下調，提示兩基因間的表達可能存在相互影響，鹽脅迫條件下兩基因間的遺傳學關系有待進一步研究。 線粒體是真核生物能量代謝的中心，在物質代謝、細胞凋亡過.程中發(fā)揮了重要的作用?；蛐酒Y果顯示，經0.6M NaCl處理45 min后，與野生型菌株相比，BDF1基因缺失造成鹽脅迫條件下大量線粒體功能相關基因表達下降。其中包括：線粒體核糖體基因(MRPL3，MRP4、MRP7和MRP11)，細胞色素C基因CYC1，線粒體延伸因子

14、基因MEF1和線粒體纈氨酰-tRNA合成酶基因VAS1，該結果提示，Bdf1p可能在維持鹽脅迫條件下線粒體的正常功能方面發(fā)揮重要作用。線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，△ψm)和胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量是評價線粒體功能的的重要指標。利用還原型線粒體特異性熒光探針MitoTracker Red CMXRos對鹽脅迫處理后野生型菌株和bdf1Δ菌株

15、中線粒體膜電位的變化進行了檢測。實驗結果表明，經0.6 M NaCI處理45 min后，Mito Tracker Red CMXRos探針在野生型菌株細胞中仍處于聚集狀態(tài)，呈現(xiàn)網狀分布的熒光線條，而大約20％左右的bdf1△菌株細胞呈現(xiàn)彌散狀分布的熒光，說明這些細胞的線粒體跨膜電位下降或消失。 細胞凋亡(apoptosis)是指細胞在一定的外界刺激或病理條件下，受基因控制的一種細胞自主的有序的死亡。線粒體功能紊亂與酵母細胞凋亡的