WRKY轉(zhuǎn)錄因子SIDRW1和NAC轉(zhuǎn)錄因子SISRN1在番茄抗性反應(yīng)中的功能研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子作為復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的成員，在調(diào)節(jié)植物應(yīng)對(duì)來(lái)自周圍環(huán)境因子脅迫的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。其中，WRKY、NAC等轉(zhuǎn)錄因子家族成員在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能。而目前關(guān)于這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族的研究主要集中在水稻和擬南芥中，番茄等其他植物中的研究很少。
　　 本文從番茄中克隆了12個(gè)NAC和6個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，并且主要利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)等技術(shù)鑒定了它們?cè)诜训挚共≡约胺巧锩{迫過(guò)程

2、中的作用，初步篩選出2個(gè)具有重要調(diào)節(jié)功能的基因SlDRW1(defense-relatedWRKY1)和SlSRN1(stress-related NAC1)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子S1DRW1在番茄與灰霉互作過(guò)程中是一個(gè)正調(diào)控因子。分析發(fā)現(xiàn)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因SlDRW1編碼一個(gè)由360個(gè)氨基酸組成的蛋白，根據(jù)推測(cè)其分子量大約為39.7 kDa，等電點(diǎn)為8.13。而且，它在序列上與另外兩個(gè)番茄WRKY轉(zhuǎn)錄因子

3、基因SlWRKY1和SlWRKY2分別具有99％和91％的相似度。進(jìn)一步對(duì)SlDRW1和SlWRKY1的ORF氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因?yàn)橥换?。通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段驗(yàn)證了S1DRW1的轉(zhuǎn)錄激活活性，結(jié)果表明，它可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子。GFP融合蛋白分析顯示，該基因定位于細(xì)胞核內(nèi)。接種灰霉病菌后，SlDRW1在番茄葉片內(nèi)的表達(dá)在接種后24h(24hpi)突然升高，48hpi達(dá)到高峰，從24hpi開(kāi)始持續(xù)保持在較高表達(dá)水平;然而，接種Ps

4、t DC3000后僅在48hpi略有上調(diào)表達(dá)，其余時(shí)間點(diǎn)均恢復(fù)到正常表達(dá)水平。用SA、JA誘導(dǎo)后均有不同水平的上調(diào)表達(dá)但ACC處理后，SlDRW1的表達(dá)水平基本上沒(méi)有明顯變化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SlDRW1基因在番茄與病原菌互作中的功能我們構(gòu)建了其VIGS表達(dá)載體。Realtime-PCR實(shí)驗(yàn)表明，利用VIGS技術(shù)，可以使SlDRW1在番茄中的轉(zhuǎn)錄水平平均下調(diào)50-80％，最高可達(dá)90％以上。SlDRW1沉默的番茄葉片離體接種灰霉后，病斑直

5、徑明顯比對(duì)照大。我們同時(shí)構(gòu)建該基因瞬時(shí)過(guò)表達(dá)載體，結(jié)果，瞬間過(guò)表達(dá)處理過(guò)的葉片抵抗灰霉的能力明顯提高，主要表現(xiàn)在病斑較對(duì)照小。SlDRW1沉默的番茄植株接種灰霉48 h后，體內(nèi)活性氧積累明顯比對(duì)照少。為了進(jìn)一步探明S1DRW1發(fā)揮作用的內(nèi)在機(jī)制，驗(yàn)證了接種灰霉菌以后，幾個(gè)PR基因在處理和對(duì)照植物中的表達(dá)差異。其中，PR1a、PR1b、PR2a、PR3a、PR5、PR7均上調(diào)表達(dá)，而PR2b、PR3b的表達(dá)與對(duì)照沒(méi)有差異。這表明SlDRW

6、1可能通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧和部分PR基因的表達(dá)而影響植物對(duì)病原物的抗性。雖然，SlDRW1在番茄與灰霉（Botrytis cinerea）互作中是一個(gè)正調(diào)控因子，但對(duì)番茄抵御細(xì)菌性葉斑病、干旱和氧化脅迫中沒(méi)有明顯作用。
　　 同時(shí)發(fā)現(xiàn)，NAC轉(zhuǎn)錄因子S1SRN1在番茄與灰霉和細(xì)菌性葉斑病互作中均為正調(diào)控因子，而且，它在番茄抵抗干旱脅迫過(guò)程中是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。該基因在灰霉菌、SA和JA誘導(dǎo)下均有一定程度的上調(diào)表達(dá)，而Pst DC3000