WRKY轉錄因子SIDRW1和NAC轉錄因子SISRN1在番茄抗性反應中的功能研究.pdf

1、轉錄因子作為復雜的信號網絡中的成員，在調節(jié)植物應對來自周圍環(huán)境因子脅迫的過程中發(fā)揮著重要的作用。其中，WRKY、NAC等轉錄因子家族成員在植物生長發(fā)育和抗逆等過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)功能。而目前關于這兩個轉錄因子家族的研究主要集中在水稻和擬南芥中，番茄等其他植物中的研究很少。
　　 本文從番茄中克隆了12個NAC和6個WRKY轉錄因子基因，并且主要利用病毒誘導的基因沉默(VIGS)等技術鑒定了它們在番茄抵抗病原菌以及非生物脅迫過程

2、中的作用，初步篩選出2個具有重要調節(jié)功能的基因SlDRW1(defense-relatedWRKY1)和SlSRN1(stress-related NAC1)。
　　 實驗結果表明，WRKY轉錄因子S1DRW1在番茄與灰霉互作過程中是一個正調控因子。分析發(fā)現，WRKY轉錄因子基因SlDRW1編碼一個由360個氨基酸組成的蛋白，根據推測其分子量大約為39.7 kDa，等電點為8.13。而且，它在序列上與另外兩個番茄WRKY轉錄因子

3、基因SlWRKY1和SlWRKY2分別具有99％和91％的相似度。進一步對SlDRW1和SlWRKY1的ORF氨基酸序列比對分析發(fā)現，這兩個基因為同一基因。通過實驗手段驗證了S1DRW1的轉錄激活活性，結果表明，它可能是一個轉錄抑制子。GFP融合蛋白分析顯示，該基因定位于細胞核內。接種灰霉病菌后，SlDRW1在番茄葉片內的表達在接種后24h(24hpi)突然升高，48hpi達到高峰，從24hpi開始持續(xù)保持在較高表達水平;然而，接種Ps

4、t DC3000后僅在48hpi略有上調表達，其余時間點均恢復到正常表達水平。用SA、JA誘導后均有不同水平的上調表達但ACC處理后，SlDRW1的表達水平基本上沒有明顯變化。為了進一步驗證SlDRW1基因在番茄與病原菌互作中的功能我們構建了其VIGS表達載體。Realtime-PCR實驗表明，利用VIGS技術，可以使SlDRW1在番茄中的轉錄水平平均下調50-80％，最高可達90％以上。SlDRW1沉默的番茄葉片離體接種灰霉后，病斑直

5、徑明顯比對照大。我們同時構建該基因瞬時過表達載體，結果，瞬間過表達處理過的葉片抵抗灰霉的能力明顯提高，主要表現在病斑較對照小。SlDRW1沉默的番茄植株接種灰霉48 h后，體內活性氧積累明顯比對照少。為了進一步探明S1DRW1發(fā)揮作用的內在機制，驗證了接種灰霉菌以后，幾個PR基因在處理和對照植物中的表達差異。其中，PR1a、PR1b、PR2a、PR3a、PR5、PR7均上調表達，而PR2b、PR3b的表達與對照沒有差異。這表明SlDRW

6、1可能通過調節(jié)活性氧和部分PR基因的表達而影響植物對病原物的抗性。雖然，SlDRW1在番茄與灰霉（Botrytis cinerea）互作中是一個正調控因子，但對番茄抵御細菌性葉斑病、干旱和氧化脅迫中沒有明顯作用。
　　 同時發(fā)現，NAC轉錄因子S1SRN1在番茄與灰霉和細菌性葉斑病互作中均為正調控因子，而且，它在番茄抵抗干旱脅迫過程中是一個負調控因子。該基因在灰霉菌、SA和JA誘導下均有一定程度的上調表達，而Pst DC3000