轉(zhuǎn)錄因子DEC1調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖機(jī)制的研究.pdf

1、背景
　　 胃癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤形式，其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制一直是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。腫瘤相關(guān)基因或特異基因表達(dá)水平的變化，多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的激活均可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。同時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控作用是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，研究其在腫瘤中的具體表達(dá)調(diào)控模式，可能為腫瘤治療提供新的預(yù)測(cè)指標(biāo)和干預(yù)靶點(diǎn)。
　　 DEC1(Differentiatedembryo-chondrocyteexpress

2、edgene)是一個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育基因，也是具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。以往關(guān)于DEC1的研究多集中于生物鐘調(diào)控、細(xì)胞分化及免疫應(yīng)答。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)它與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)，缺氧、血清饑餓、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、感染等均可誘導(dǎo)腫瘤中DEC1信號(hào)通路的啟動(dòng)，并且其調(diào)控的靶基因都是參與細(xì)胞增殖及凋亡的重要分子。但DEC1究竟是作為癌基因還是抑癌基因發(fā)揮作用充滿爭(zhēng)議。主要體現(xiàn)在:(1)DEC1在腫瘤中呈組織細(xì)胞特異性的表達(dá)模式，表達(dá)

3、的上調(diào)或下調(diào)與腫瘤類型密切相關(guān);(2)腫瘤中DEC1表達(dá)的臨床意義尚不統(tǒng)一;(3)DEC1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及對(duì)抑癌基因和促癌基因的作用尚無(wú)定論。DEC1在腫瘤細(xì)胞中的這種雙重作用主要與DEC1及其上下游調(diào)控分子的時(shí)空分布及表達(dá)量密切相關(guān)。因而需要更加深入的研究不同腫瘤中DEC1的表達(dá)調(diào)控模式。雖然我們的前期研究已表明，DEC1基因在胃癌組織中呈高表達(dá)，但DEC1基因的表達(dá)在胃癌發(fā)生發(fā)展中究竟是發(fā)揮抑癌作用還是促癌作用及其具體

4、的機(jī)制尚不明確，這正是本研究擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題。
　　 目的
　　 1.檢測(cè)DEC1在胃癌組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，以及與細(xì)胞增殖抗原Ki67表達(dá)的相關(guān)性，探討其潛在的臨床價(jià)值;
　　 2.建立DEC1慢病毒RNA干擾載體，獲得穩(wěn)定基因敲除的胃癌細(xì)胞，為研究DEC1表達(dá)調(diào)控作用提供良好的細(xì)胞模型;
　　 3.探討DEC1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用及其機(jī)制，為明確其是否可作為胃癌治療的

5、新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法
　　 1.免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)173例胃癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織中DEC1的表達(dá)情況，分析DEC1表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系及其與Ki67表達(dá)的相關(guān)性。
　　 2.構(gòu)建包裝DEC1-shRNA慢病毒載體(pKL2099-DEC1shRNA)和陰性對(duì)照載體(pKL2099-NCshRNA);在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝和滴度測(cè)定;慢病毒載體感染胃癌細(xì)胞BGC823和MGC8

6、03細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株;RT-PCR及westernblot驗(yàn)證慢病毒載體的有效性。
　　 3.采用CCK-8實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)觀察抑制DEC1表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞體外增殖能力、克隆形成能力及細(xì)胞周期的影響。
　　 4.AnnexinV-PE/7-AAD雙染色法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡;Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。
　　 5.Westernblot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)分子Survi

7、vin、p53及Caspase3的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果
　　 1.DEC1在胃癌組織和癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為83.8％和23.7％(P＜0.05)，并且DEC1的表達(dá)與組織的分化程度負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期無(wú)關(guān)(P＞0.05);DEC1在胃癌組織中的表達(dá)與Ki67蛋白的表達(dá)正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.249，P＜0.05)。
　　 2.通過(guò)陽(yáng)性克隆測(cè)序，證

8、實(shí)針對(duì)DEC1及陰性對(duì)照的載體分別構(gòu)建成功;兩個(gè)慢病毒載體pKL2099-DEC1shRNA、pKL2099-NCshRNA滴度分別為3E+9TU/ml和6E+9TU/ml;嘌呤霉素(puromycin)篩選得到的穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株BGC823-DEC1shRNA及MGC803-DEC1shRNA細(xì)胞中DEC1mRNA表達(dá)水平的抑制率分別為(88.24％±1.47％)和(79.34％±1.09％)，蛋白水平的抑制率為(75.43％±2.3

9、1％)和(69.36％±2.11)，差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　 3.穩(wěn)定抑制DEC1表達(dá)的BGC823-DEC1shRNA組細(xì)胞與陰性對(duì)照組BGC823-NCshRNA細(xì)胞相比，增殖率明顯下降(P＜0.05);平板克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)BGC823-DEC1shRNA組細(xì)胞形成克隆的數(shù)量明顯低于BGC823-NCshRNA組細(xì)胞;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期結(jié)果顯示BGC823-DEC1shRNA組細(xì)胞處于G0/G1細(xì)胞增多，而

10、S期與G2/M細(xì)胞減少，差異有顯著性(p＜0.05）。
　　 4.AnnexinV-PE/7-AAD雙染色法結(jié)果表明BGC823-DEC1shRNA組早期凋亡細(xì)胞比例高于陰性對(duì)照BGC823-NCshRNA(34.98％±1.05％vs5.95％±0.98)，差異有顯著性(p＜0.05)。慢病毒感染胃癌細(xì)胞7d后，在BGC823-DEC1shRNA組細(xì)胞中可以觀察到典型的核濃縮、核碎裂等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。
　　 5.

11、Westernblot結(jié)果提示，下調(diào)DEC1的表達(dá)后，細(xì)胞中的Survivin的表達(dá)下調(diào)，而p53、Caspase3表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論
　　 DEC1在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，其表達(dá)水平隨腫瘤病理分級(jí)增高而顯著升高，并且與Ki67的表達(dá)正相關(guān)，說(shuō)明DEC1的高表達(dá)與胃癌的惡性進(jìn)程密切相關(guān);成功構(gòu)建了靶向DEC1的慢病毒RNAi表達(dá)載體，分別感染胃癌細(xì)胞BGC823和MGC803，經(jīng)嘌呤霉素(puromy