益氣活血方藥配伍治療冠心病療效及作用機(jī)制的系統(tǒng)性研究.pdf

1、冠心病是臨床上常見的心血管系統(tǒng)疾病之一，應(yīng)當(dāng)屬于祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“胸痹”、“心痛”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為其為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛多為氣虛，標(biāo)實(shí)則多為血瘀。目前開展的中醫(yī)藥治療冠心病療效及作用機(jī)制研究，多為單一臨床療效評價，或藥理作用機(jī)制研究，而較少從系統(tǒng)性研究角度，較為全面地，循序漸近地揭示中醫(yī)藥治療冠心病的核心藥物、有效法則、臨床療效、藥理機(jī)制等。故本研究結(jié)合導(dǎo)師多年診療冠心病的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，采用中醫(yī)藥文獻(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘方法，探索中醫(yī)藥治療冠心病的用

2、藥規(guī)律，通過搜集整理《中華醫(yī)典》收錄的治療冠心病名藥，篩選出冠心病的主要治則治法為益氣活血法，進(jìn)而采用循證醫(yī)學(xué)的系統(tǒng)評價方法，全面獲取益氣活血方藥配伍治療冠心病的臨床隨機(jī)對照試驗(yàn)研究，評估現(xiàn)代醫(yī)家應(yīng)用益氣活血方藥配伍治療冠心病的臨床療效及其安全性，最終確定益氣活血方藥配伍治療冠心病的代表藥物黃芪、丹參，并分別提取兩者有效成分黃芪甲苷、丹參酮 IIA，采用細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)研究方法，觀察其對分化后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenc

3、hymal stromal cells，MSCs）間隙連接蛋白（Connexin protein，Cx）表達(dá)、縫隙連接通道（Gap junction channel，GJC）功能調(diào)節(jié)以及促新生血管生成能力的影響，以期為中醫(yī)藥治療冠心病藥物研發(fā)提供研究思路指導(dǎo)及有效干預(yù)措施。
　　第一部分《中華醫(yī)典·名藥》收錄治療冠心病用藥規(guī)律研究
　　1.目的：
　　明確《中華醫(yī)典·名藥》胸痹心痛證治用藥特點(diǎn)及主要治則治法。
　

4、　2.研究方法：
　　計算機(jī)檢索《中華醫(yī)典》光盤版（第5版）名藥部分，以“胸痹”、“心痛”、“心悸”、“怔忡”、“冠心病”、“心絞痛”、“心肌缺血”、“冠狀動脈硬化”等為檢索詞，檢索方式為內(nèi)容檢索，通過制定嚴(yán)格納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，篩選及整理治療胸痹心痛方藥數(shù)據(jù)，建立Excel數(shù)據(jù)庫，采用SPSS19.0軟件統(tǒng)計分析。
　　3.結(jié)果：
　　從《中華醫(yī)典·名藥》檢索到264首方藥約8萬字的文獻(xiàn)資料，依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，篩選出1

5、00首符合納排標(biāo)準(zhǔn)的治療冠心病方藥，研究結(jié)果顯示：①胸痹心痛治療法則：以益氣補(bǔ)虛、活血祛瘀為主；②治療胸痹心痛單味中藥使用頻次：由高至低分別為丹參、黃芪、人參、川芎、冰片等；③治療胸痹心痛中藥功效：按功效分為16大類，補(bǔ)虛類中藥高達(dá)（33％），其中以補(bǔ)氣藥所占比重最大（43%），其次為為活血化瘀類中藥（14%）；④治療胸痹心痛單味中藥性味歸經(jīng)：藥味以甘（34%）、辛（30%）味為主。藥性多以溫?zé)釣橹鳌w經(jīng)主入心（23%）、脾（18%）、

6、肝（18%）經(jīng)。
　　4.結(jié)論：
　　《中華醫(yī)典·名藥》收錄治療胸痹心痛前三位高頻藥物為丹參、黃芪、人參。其核心治療法則為益氣、活血，兼以理氣，安神。
　　第二部分益氣活血方藥配伍治療冠心病的系統(tǒng)評價（Meta分析）
　　1.目的：
　　評價益氣活血方藥配伍治療冠心病的臨床有效性及安全性。
　　2.研究方法：
　　2.1計算機(jī)檢索中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(China Biology Medicin

7、e disc，CBM)、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)、維普期刊全文數(shù)據(jù)庫（VIP）、Pubmed等中英文數(shù)據(jù)庫（檢索時間范圍為2010-2014年）。采用循證檢索策略及方法，全面獲取益氣活血方藥配伍治療冠心病的隨機(jī)及半隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)，通過制定嚴(yán)格的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確篩選得到目標(biāo)研究文獻(xiàn)。
　　2.2制定文獻(xiàn)資料提取表，由雙人獨(dú)立提取研究基本情況、病患基本信息、合并病信息、干預(yù)措施、臨床療效指標(biāo)等，不一致者由第三方專家組成員裁

8、定。并采用改良Jadad量表評價研究文獻(xiàn)質(zhì)量。
　　2.3采用RevMan5.3軟件合并分析療效指標(biāo)效應(yīng)量，系統(tǒng)評價益氣活血方藥配伍治療冠心病的臨床有效性。
　　2.4采用描述性研究方法評價益氣活血方藥配伍治療冠心病的臨床安全性。
　　3.結(jié)果：
　　3.1兩名研究者逐一閱讀所檢索到的624篇文獻(xiàn)資料，嚴(yán)格參照納排標(biāo)準(zhǔn)共28篇合計病例2900例入選，其中治療組1513例，對照組1387例。采用RevMan5.3軟

9、件分析得：在臨床總療效、中醫(yī)證候療效、心絞痛療效、心電圖療效等指標(biāo)改善率方面，西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)加益氣活血方藥配伍治療冠心病，優(yōu)于單純西醫(yī)常規(guī)治療，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.2分析以西醫(yī)常規(guī)治療消心痛為對照組的631例冠心病病例結(jié)果顯示：西醫(yī)常規(guī)治療消心痛基礎(chǔ)上加用益氣活血方藥配伍，與單純消心痛為主的西醫(yī)常規(guī)治療相比較，其臨床總療效、心電圖療效合并OR[95％CI]值分別為3.74[2.08，6.74]、2.23

10、[1.92，3.85]，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），說明在西醫(yī)常規(guī)治療消心痛基礎(chǔ)上加益氣活血方藥配伍的治療組對冠心病臨床總療效、心電圖療效改善率，優(yōu)于單純以消心痛為主的西醫(yī)常規(guī)治療對照組。
　　3.3分析以消心痛和阿司匹林聯(lián)合運(yùn)用的西醫(yī)常規(guī)治療為對照組的1877例冠心病患者，結(jié)果顯示：在以消心痛及阿司匹林合用的西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上加益氣活血方藥配伍，與單純消心痛及阿司匹林合用的西醫(yī)常規(guī)治療比較，其臨床總療效、中醫(yī)證候療效、心絞痛

11、療效和心電圖療效合并OR[95％CI]值分別為4.48[3.25，6.19]、5.21[2.13，12.75]、2.77[1.57，4.88]、2.57[1.92，3.45]，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），說明治療組對冠心病臨床總療效、中醫(yī)證候療效、心絞痛療效和心電圖療效改善，優(yōu)于以消心痛和阿司匹林為主的西醫(yī)常規(guī)治療對照組。
　　3.4對納入研究的2900例冠心病病例進(jìn)行不良反應(yīng)/事件觀察，益氣活血方藥配伍治療組共出現(xiàn)5例不良反

12、應(yīng)/事件，均為惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)，而單純西醫(yī)常規(guī)治療組出現(xiàn)14例不良反應(yīng)/事件，多表現(xiàn)為頭暈、惡心、無力等癥狀。
　　4.結(jié)論：
　　4.1在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用益氣活血方藥配伍治療冠心病，在臨床總療效、中醫(yī)證候療效、心絞痛療效和心電圖療效等方面，優(yōu)于單純以消心痛或消心痛及阿司匹林為主的西醫(yī)常規(guī)治療。
　　4.2益氣活血方藥配伍治療冠心病，不良反應(yīng)較少。
　　第三部分丹參酮IIA、黃芪甲苷及其配伍對MSCs

13、細(xì)胞連接蛋白表達(dá)及促血管生成作用的研究
　　1.目的：
　　從黃芪甲苷、丹參酮IIA及其配伍對 MSCs連接通訊功能的調(diào)節(jié)角度，探討此配伍是否通過間隙連接蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)連接通訊功能而促進(jìn)血管生成，為益氣活血方藥配伍治療冠心病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　2.研究方法：
　　2.1采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)乳鼠MSCs，獲得原代MSCs，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)，流式細(xì)胞儀鑒定 MSCs表面分子，并將該細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化，然

14、后采用免疫組化法觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞 FⅧ因子表達(dá)。
　　2.2誘導(dǎo)后的內(nèi)皮樣細(xì)胞隨機(jī)分為如下4組并干預(yù)72小時：①空白組；②丹參酮IIA組；③黃芪甲苷組；④合用組。
　　2.3分別采用實(shí)時定量 PCR、Western blot檢測誘導(dǎo)后 MSCs細(xì)胞Cx37、Cx40、Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)。
　　2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測內(nèi)皮樣細(xì)胞間隙連接通訊功能。
　　2.5 MTT法檢測誘導(dǎo)后內(nèi)皮樣細(xì)胞的增殖。
　　2.6

15、流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)后內(nèi)皮樣細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　2.7三維基質(zhì)膠立體培養(yǎng)法檢測內(nèi)皮樣細(xì)胞的毛細(xì)血管管狀結(jié)構(gòu)形成能力。
　　3.結(jié)果：
　　3.1經(jīng)過全骨髓貼壁法獲得的細(xì)胞呈短梭形、紡錘形，流式細(xì)胞術(shù)檢測提示CD44、CD90分子表達(dá)呈陽性，CD45、CD34分子表達(dá)呈陰性，證實(shí)提取的原代細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)VEGF、bFGF誘導(dǎo)該細(xì)胞，并采用免疫組化法觀察FⅧ因子表達(dá)，結(jié)果提示FⅧ因子相關(guān)抗原表達(dá)呈陽性，證實(shí)誘導(dǎo)

16、后細(xì)胞為內(nèi)皮樣細(xì)胞。
　　3.2實(shí)時定量PCR檢測誘導(dǎo)后 MSCs提示：益氣活血合用組、丹參酮IIA組、黃芪甲苷組、空白組均可見 Cx37、Cx40、Cx43mRNA的表達(dá)，其中合用組表達(dá)最強(qiáng)，丹參酮IIA組、黃芪甲苷組、空白組表達(dá)依次減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Western blot檢測誘導(dǎo)后 MSCs的 Cx37、Cx40、Cx43蛋白的表達(dá)合用組高于單用組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），黃芪甲苷組略低于丹參酮

17、IIA組，無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3.3染料劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：合用組熒光染料主要出現(xiàn)在劃痕以外的3-4層細(xì)胞內(nèi)且較為明顯；丹參酮IIA組熒光染料則主要出現(xiàn)在劃痕2-3層細(xì)胞中而且亮度較高；黃芪甲苷組熒光染料出現(xiàn)在劃痕1-2層細(xì)胞中亮度較丹參酮IIA組略低；而空白組熒光染料主要出現(xiàn)在劃痕1層細(xì)胞中且亮度最低。其中合用組強(qiáng)于丹參酮IIA組和黃芪甲苷組，后兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖結(jié)果提示：合用組、丹參酮I

18、IA組、黃芪甲苷組細(xì)胞增殖比例均高于空白組，合用組的增殖能力高于丹參酮IIA組與黃芪甲苷組，而丹參酮IIA組的增殖能力大于黃芪甲苷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示合用組、丹參酮IIA組、黃芪甲苷組細(xì)胞S期比例明顯高于空白組，合用組高于單用組，單用組中丹參酮IIA組細(xì)胞S期比例高于黃芪甲苷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.6三維基質(zhì)膠立體培養(yǎng)法檢測內(nèi)皮樣細(xì)胞的毛細(xì)血