益氣活血方藥配伍治療冠心病療效及作用機(jī)制的系統(tǒng)性研究.pdf

1、冠心病是臨床上常見(jiàn)的心血管系統(tǒng)疾病之一，應(yīng)當(dāng)屬于祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“胸痹”、“心痛”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為其為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛多為氣虛，標(biāo)實(shí)則多為血瘀。目前開(kāi)展的中醫(yī)藥治療冠心病療效及作用機(jī)制研究，多為單一臨床療效評(píng)價(jià)，或藥理作用機(jī)制研究，而較少?gòu)南到y(tǒng)性研究角度，較為全面地，循序漸近地揭示中醫(yī)藥治療冠心病的核心藥物、有效法則、臨床療效、藥理機(jī)制等。故本研究結(jié)合導(dǎo)師多年診療冠心病的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，采用中醫(yī)藥文獻(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘方法，探索中醫(yī)藥治療冠心病的用

2、藥規(guī)律，通過(guò)搜集整理《中華醫(yī)典》收錄的治療冠心病名藥，篩選出冠心病的主要治則治法為益氣活血法，進(jìn)而采用循證醫(yī)學(xué)的系統(tǒng)評(píng)價(jià)方法，全面獲取益氣活血方藥配伍治療冠心病的臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究，評(píng)估現(xiàn)代醫(yī)家應(yīng)用益氣活血方藥配伍治療冠心病的臨床療效及其安全性，最終確定益氣活血方藥配伍治療冠心病的代表藥物黃芪、丹參，并分別提取兩者有效成分黃芪甲苷、丹參酮 IIA，采用細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)研究方法，觀察其對(duì)分化后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenc

3、hymal stromal cells，MSCs）間隙連接蛋白（Connexin protein，Cx）表達(dá)、縫隙連接通道（Gap junction channel，GJC）功能調(diào)節(jié)以及促新生血管生成能力的影響，以期為中醫(yī)藥治療冠心病藥物研發(fā)提供研究思路指導(dǎo)及有效干預(yù)措施。
　　第一部分《中華醫(yī)典·名藥》收錄治療冠心病用藥規(guī)律研究
　　1.目的：
　　明確《中華醫(yī)典·名藥》胸痹心痛證治用藥特點(diǎn)及主要治則治法。
　

4、　2.研究方法：
　　計(jì)算機(jī)檢索《中華醫(yī)典》光盤(pán)版（第5版）名藥部分，以“胸痹”、“心痛”、“心悸”、“怔忡”、“冠心病”、“心絞痛”、“心肌缺血”、“冠狀動(dòng)脈硬化”等為檢索詞，檢索方式為內(nèi)容檢索，通過(guò)制定嚴(yán)格納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，篩選及整理治療胸痹心痛方藥數(shù)據(jù)，建立Excel數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。
　　3.結(jié)果：
　　從《中華醫(yī)典·名藥》檢索到264首方藥約8萬(wàn)字的文獻(xiàn)資料，依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，篩選出1

5、00首符合納排標(biāo)準(zhǔn)的治療冠心病方藥，研究結(jié)果顯示：①胸痹心痛治療法則：以益氣補(bǔ)虛、活血祛瘀為主；②治療胸痹心痛單味中藥使用頻次：由高至低分別為丹參、黃芪、人參、川芎、冰片等；③治療胸痹心痛中藥功效：按功效分為16大類，補(bǔ)虛類中藥高達(dá)（33％），其中以補(bǔ)氣藥所占比重最大（43%），其次為為活血化瘀類中藥（14%）；④治療胸痹心痛單味中藥性味歸經(jīng)：藥味以甘（34%）、辛（30%）味為主。藥性多以溫?zé)釣橹鳌w經(jīng)主入心（23%）、脾（18%）、

6、肝（18%）經(jīng)。
　　4.結(jié)論：
　　《中華醫(yī)典·名藥》收錄治療胸痹心痛前三位高頻藥物為丹參、黃芪、人參。其核心治療法則為益氣、活血，兼以理氣，安神。
　　第二部分益氣活血方藥配伍治療冠心病的系統(tǒng)評(píng)價(jià)（Meta分析）
　　1.目的：
　　評(píng)價(jià)益氣活血方藥配伍治療冠心病的臨床有效性及安全性。
　　2.研究方法：
　　2.1計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(China Biology Medicin

7、e disc，CBM)、中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)(CNKI)、維普期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)（VIP）、Pubmed等中英文數(shù)據(jù)庫(kù)（檢索時(shí)間范圍為2010-2014年）。采用循證檢索策略及方法，全面獲取益氣活血方藥配伍治療冠心病的隨機(jī)及半隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)，通過(guò)制定嚴(yán)格的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確篩選得到目標(biāo)研究文獻(xiàn)。
　　2.2制定文獻(xiàn)資料提取表，由雙人獨(dú)立提取研究基本情況、病患基本信息、合并病信息、干預(yù)措施、臨床療效指標(biāo)等，不一致者由第三方專家組成員裁

8、定。并采用改良Jadad量表評(píng)價(jià)研究文獻(xiàn)質(zhì)量。
　　2.3采用RevMan5.3軟件合并分析療效指標(biāo)效應(yīng)量，系統(tǒng)評(píng)價(jià)益氣活血方藥配伍治療冠心病的臨床有效性。
　　2.4采用描述性研究方法評(píng)價(jià)益氣活血方藥配伍治療冠心病的臨床安全性。
　　3.結(jié)果：
　　3.1兩名研究者逐一閱讀所檢索到的624篇文獻(xiàn)資料，嚴(yán)格參照納排標(biāo)準(zhǔn)共28篇合計(jì)病例2900例入選，其中治療組1513例，對(duì)照組1387例。采用RevMan5.3軟

9、件分析得：在臨床總療效、中醫(yī)證候療效、心絞痛療效、心電圖療效等指標(biāo)改善率方面，西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)加益氣活血方藥配伍治療冠心病，優(yōu)于單純西醫(yī)常規(guī)治療，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.2分析以西醫(yī)常規(guī)治療消心痛為對(duì)照組的631例冠心病病例結(jié)果顯示：西醫(yī)常規(guī)治療消心痛基礎(chǔ)上加用益氣活血方藥配伍，與單純消心痛為主的西醫(yī)常規(guī)治療相比較，其臨床總療效、心電圖療效合并OR[95％CI]值分別為3.74[2.08，6.74]、2.23

10、[1.92，3.85]，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說(shuō)明在西醫(yī)常規(guī)治療消心痛基礎(chǔ)上加益氣活血方藥配伍的治療組對(duì)冠心病臨床總療效、心電圖療效改善率，優(yōu)于單純以消心痛為主的西醫(yī)常規(guī)治療對(duì)照組。
　　3.3分析以消心痛和阿司匹林聯(lián)合運(yùn)用的西醫(yī)常規(guī)治療為對(duì)照組的1877例冠心病患者，結(jié)果顯示：在以消心痛及阿司匹林合用的西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上加益氣活血方藥配伍，與單純消心痛及阿司匹林合用的西醫(yī)常規(guī)治療比較，其臨床總療效、中醫(yī)證候療效、心絞痛

11、療效和心電圖療效合并OR[95％CI]值分別為4.48[3.25，6.19]、5.21[2.13，12.75]、2.77[1.57，4.88]、2.57[1.92，3.45]，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說(shuō)明治療組對(duì)冠心病臨床總療效、中醫(yī)證候療效、心絞痛療效和心電圖療效改善，優(yōu)于以消心痛和阿司匹林為主的西醫(yī)常規(guī)治療對(duì)照組。
　　3.4對(duì)納入研究的2900例冠心病病例進(jìn)行不良反應(yīng)/事件觀察，益氣活血方藥配伍治療組共出現(xiàn)5例不良反

12、應(yīng)/事件，均為惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)，而單純西醫(yī)常規(guī)治療組出現(xiàn)14例不良反應(yīng)/事件，多表現(xiàn)為頭暈、惡心、無(wú)力等癥狀。
　　4.結(jié)論：
　　4.1在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用益氣活血方藥配伍治療冠心病，在臨床總療效、中醫(yī)證候療效、心絞痛療效和心電圖療效等方面，優(yōu)于單純以消心痛或消心痛及阿司匹林為主的西醫(yī)常規(guī)治療。
　　4.2益氣活血方藥配伍治療冠心病，不良反應(yīng)較少。
　　第三部分丹參酮IIA、黃芪甲苷及其配伍對(duì)MSCs

13、細(xì)胞連接蛋白表達(dá)及促血管生成作用的研究
　　1.目的：
　　從黃芪甲苷、丹參酮IIA及其配伍對(duì) MSCs連接通訊功能的調(diào)節(jié)角度，探討此配伍是否通過(guò)間隙連接蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)連接通訊功能而促進(jìn)血管生成，為益氣活血方藥配伍治療冠心病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　2.研究方法：
　　2.1采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)乳鼠MSCs，獲得原代MSCs，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)，流式細(xì)胞儀鑒定 MSCs表面分子，并將該細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化，然

14、后采用免疫組化法觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞 FⅧ因子表達(dá)。
　　2.2誘導(dǎo)后的內(nèi)皮樣細(xì)胞隨機(jī)分為如下4組并干預(yù)72小時(shí)：①空白組；②丹參酮IIA組；③黃芪甲苷組；④合用組。
　　2.3分別采用實(shí)時(shí)定量 PCR、Western blot檢測(cè)誘導(dǎo)后 MSCs細(xì)胞Cx37、Cx40、Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)。
　　2.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)皮樣細(xì)胞間隙連接通訊功能。
　　2.5 MTT法檢測(cè)誘導(dǎo)后內(nèi)皮樣細(xì)胞的增殖。
　　2.6

15、流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘導(dǎo)后內(nèi)皮樣細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　2.7三維基質(zhì)膠立體培養(yǎng)法檢測(cè)內(nèi)皮樣細(xì)胞的毛細(xì)血管管狀結(jié)構(gòu)形成能力。
　　3.結(jié)果：
　　3.1經(jīng)過(guò)全骨髓貼壁法獲得的細(xì)胞呈短梭形、紡錘形，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)提示CD44、CD90分子表達(dá)呈陽(yáng)性，CD45、CD34分子表達(dá)呈陰性，證實(shí)提取的原代細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)VEGF、bFGF誘導(dǎo)該細(xì)胞，并采用免疫組化法觀察FⅧ因子表達(dá)，結(jié)果提示FⅧ因子相關(guān)抗原表達(dá)呈陽(yáng)性，證實(shí)誘導(dǎo)

16、后細(xì)胞為內(nèi)皮樣細(xì)胞。
　　3.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后 MSCs提示：益氣活血合用組、丹參酮IIA組、黃芪甲苷組、空白組均可見(jiàn) Cx37、Cx40、Cx43mRNA的表達(dá)，其中合用組表達(dá)最強(qiáng)，丹參酮IIA組、黃芪甲苷組、空白組表達(dá)依次減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Western blot檢測(cè)誘導(dǎo)后 MSCs的 Cx37、Cx40、Cx43蛋白的表達(dá)合用組高于單用組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），黃芪甲苷組略低于丹參酮

17、IIA組，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.3染料劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：合用組熒光染料主要出現(xiàn)在劃痕以外的3-4層細(xì)胞內(nèi)且較為明顯；丹參酮IIA組熒光染料則主要出現(xiàn)在劃痕2-3層細(xì)胞中而且亮度較高；黃芪甲苷組熒光染料出現(xiàn)在劃痕1-2層細(xì)胞中亮度較丹參酮IIA組略低；而空白組熒光染料主要出現(xiàn)在劃痕1層細(xì)胞中且亮度最低。其中合用組強(qiáng)于丹參酮IIA組和黃芪甲苷組，后兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果提示：合用組、丹參酮I

18、IA組、黃芪甲苷組細(xì)胞增殖比例均高于空白組，合用組的增殖能力高于丹參酮IIA組與黃芪甲苷組，而丹參酮IIA組的增殖能力大于黃芪甲苷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示合用組、丹參酮IIA組、黃芪甲苷組細(xì)胞S期比例明顯高于空白組，合用組高于單用組，單用組中丹參酮IIA組細(xì)胞S期比例高于黃芪甲苷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.6三維基質(zhì)膠立體培養(yǎng)法檢測(cè)內(nèi)皮樣細(xì)胞的毛細(xì)血