藥用植物刺五加內(nèi)生放線菌的分離、多樣性分析及活性研究.pdf

1、目的：分離藥用植物刺五加內(nèi)生放線菌株，初步建立刺五加內(nèi)生放線菌菌種資源庫。揭示刺五加內(nèi)生放線菌種屬資源多樣性及在植株不同組織部位分布情況。探究菌株抗菌活性及次級代謝產(chǎn)物合成潛能。
　　方法：采集遼寧省本溪市、吉林省梅河口市、吉林省柳河縣、黑龍江省穆棱市、河北省興隆縣（霧靈山）5地區(qū)野生刺五加植株，流水沖洗并經(jīng)表面消毒處理，按根、根莖、莖、葉等部位分割并打碎后，用8種分離培養(yǎng)基分離。挑取菌落并轉(zhuǎn)移到ISP2平板上，采用平板劃線法純化

2、菌株并于-80° C凍存。進(jìn)行菌株基因組DNA的BOX-PCR反應(yīng)，以排除重復(fù)菌株。挑選形態(tài)上差異較大菌株及具有特殊形態(tài)菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列測定及系統(tǒng)進(jìn)化分析。了解刺五加內(nèi)生放線菌種屬分布規(guī)律及菌株在刺五加各不同組織部位的分布情況。采用平板紙片法檢測刺五加內(nèi)生放線菌的抗菌活性。對菌株進(jìn)行基于PCR的聚酮合成酶（PKSI，PKSII）、非核糖體肽合成酶（NRPS）、細(xì)胞色素 p450氧化酶（CYP）和鹵化酶（Halogenas

3、e）基因檢測，考察菌株次級代謝產(chǎn)物合成潛能。
　　結(jié)果：1、分離到內(nèi)生放線菌300株，經(jīng)BOX-PCR排重后共計得到265株，選取的43株代表性菌株分屬于放線菌7個亞目，9個科，9個屬。鏈霉菌屬和小單孢菌屬是其優(yōu)勢菌屬。內(nèi)生放線菌在刺五加植株不同組織部位的分布有很大差異，由根、根莖、莖及葉中分離的放線菌株分別為110株、93株、45株和17株，根及根莖中的放線菌株占分離總數(shù)的77％，明顯多于其他組織，而葉中的比例最少僅為6%。從不

4、同培養(yǎng)基分離出的放線菌數(shù)目有較大差異。LNMS培養(yǎng)基分離菌株效果最佳，共得到60株。海藻糖-無機(jī)鹽培養(yǎng)基分離的菌株最少，共17株。2、將分離所得的265株刺五加內(nèi)生放線菌進(jìn)行抗菌活性檢測，顯現(xiàn)出多種生物活性，對7種檢定菌均有不同程度抗性，抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)。至少具有1種抗菌活性的菌株為78株。3從基因檢測結(jié)果來看，次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因陽性的菌株為172株，其中PKSⅠ，PKSⅡ，NRPS，Halo和CYP基因的陽性檢出菌分別為48