胃癌診斷系列分子影像探針的研發(fā)與成像研究.pdf

1、背景：胃癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的惡性腫瘤之一，其高病死率與發(fā)現(xiàn)時(shí)病變已處于晚期密切相關(guān)，早期診斷是降低胃癌病死率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和有效手段，但現(xiàn)有臨床診斷手段在診斷靈敏度與特異性上均不能滿足早診的需求。MG7Ab是胃癌特異性單克隆抗體，靶向特異性強(qiáng)、靈敏度高，具有作為胃癌早期診斷分子標(biāo)志物的應(yīng)用前景。分子影像作為新興的成像手段，具有可在活體連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察特定分子改變的特點(diǎn)，逐漸成為基礎(chǔ)研究中不可或缺的手段，也極具臨床應(yīng)用前景，其中多模態(tài)成像可

2、以使不同的成像模態(tài)互補(bǔ)，得到更為精準(zhǔn)和信息量更大的影像，為診斷提供有力證據(jù)。
　　目的：以胃癌特異性單克隆抗體MG7Ab為靶向分子，制備系列可用于胃癌診斷成像的分子影像探針：MG7Ab-Cy5.5、64Cu-NODAGA-MG7Ab以及MG7Ab-ICG等，開(kāi)展體外和在體成像研究，探索并優(yōu)化成像條件。
　　方法：
　　1.胃癌特異性單克隆抗體MG7Ab的制備與功能驗(yàn)證：
　　通過(guò)雜交瘤-腹水抗體制備系統(tǒng)制備抗體，

3、辛酸-飽和硫酸銨沉淀法及后續(xù)免疫學(xué)手段純化MG7Ab，通過(guò)Western Blot與免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證此次所制備抗體的胃癌特異性與親和力。
　　2.MG7Ab核素顯像探針的制備與表征：
　　通過(guò)化學(xué)耦聯(lián)法，將螯合劑NODAGA-NHS ester和p-NCS-benzyl-NODAGA與MG7Ab耦聯(lián)，使用64CuCl2進(jìn)行放射性標(biāo)記，利用PD-10凝膠柱收集純化放射性探針，并計(jì)算放射性標(biāo)記效率；通過(guò)PBS與FBS孵育，

4、檢驗(yàn)探針的溶液穩(wěn)定性。
　　3.MG7Ab-ICG探針的制備與表征：
　　通過(guò)不同化學(xué)修飾將ICG與MG7Ab耦聯(lián)，利用紫外-可見(jiàn)光吸收光譜對(duì)探針表征；通過(guò)PBS孵育，檢測(cè)探針的溶液穩(wěn)定性；利用濃度梯度成像，檢測(cè)探針的光聲成像性質(zhì)。
　　4.體外細(xì)胞學(xué)成像研究：
　　在細(xì)胞水平，通過(guò)細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各探針的胃癌細(xì)胞結(jié)合，利用激光共聚焦顯微鏡明確探針的結(jié)合模式，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探針結(jié)合的特異性。
　

5、　5.在體成像研究
　　建立荷胃癌細(xì)胞的裸鼠模型，分別使用IVIS活體成像、小動(dòng)物PET/CT成像、光聲成像以及近紅外成像內(nèi)鏡等系統(tǒng)，通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)的成像探索最佳成像時(shí)間，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制明確腫瘤成像的特異性，通過(guò)生物學(xué)分布研究探針在體內(nèi)的代謝情況。
　　結(jié)果：
　　1.胃癌特異性單克隆抗體MG7Ab的制備與功能：
　　成功通過(guò)雜交瘤-腹水抗體制備體系，獲得一批含高濃度MG7Ab的腹水，經(jīng)進(jìn)一步純化，共獲得干粉態(tài)M

6、G7Ab8.67mg。選用5種胃癌細(xì)胞株和永生化胃粘膜上皮細(xì)胞進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示以本次制備的MG7Ab為一抗，在胃癌細(xì)胞SGC-7901、KATOIII和MKN-28三株細(xì)胞株中出現(xiàn)了明顯的130kDa顯色條帶，胃癌細(xì)胞AGS中有弱陽(yáng)性條帶出現(xiàn)，而胃癌細(xì)胞MKN-45和永生化胃粘膜上皮細(xì)胞GES中，在相應(yīng)位置無(wú)明顯條帶出現(xiàn)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，MG7Ab與胃癌SGC-7901和MKN-28細(xì)胞株結(jié)合均主要位于細(xì)胞膜

7、部位，另在細(xì)胞漿中可見(jiàn)微弱染色，而在陰性對(duì)照GES細(xì)胞株中，未見(jiàn)胞膜及胞質(zhì)有明確染色。
　　2.MG7Ab-Cy5.5探針制備與體外、在體成像：
　　通過(guò)耦聯(lián)反應(yīng)，成功將Cy5.5-NHS ester與MG7Ab耦聯(lián)，平均每個(gè)抗體上聯(lián)有2.5個(gè)熒光分子。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)顯示，MG7Ab-Cy5.5探針可以特異性結(jié)合胃癌細(xì)胞SGC-7901和MKN-28，而不與永生化胃粘膜上皮細(xì)胞GES結(jié)合；激光共聚焦顯微鏡成像表明探針與胃癌細(xì)胞

8、結(jié)合主要定位在胞膜，并有少量胞質(zhì)分布；荷瘤裸鼠活體近紅外成像顯示探針可特異性聚集在腫瘤部位；生物學(xué)分布提示探針能特異性聚集于腫瘤部位，并主要經(jīng)肝臟代謝。
　　3.64Cu-NODAGA-MG7Ab探針制備與體外、在體成像：
　　在不同反應(yīng)條件下成功將螯合劑NODAGA-NHS ester和p-NCS-benzyl-NODAGA與MG7Ab耦聯(lián)，制備了兩種核素探針前體；在溫和反應(yīng)條件下實(shí)現(xiàn)了64Cu核素標(biāo)記，經(jīng)PD-10分離純

9、化，測(cè)得兩種探針的標(biāo)記效率分別為85.7％和80.9%；PBS與FBS孵育后，兩種探針均有較好的溶液穩(wěn)定性，在孵育240min后，兩種探針的完整度分別為96.37%、94.60%（PBS中）和95.39%、94.75%（40%FBS中）；細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明兩種探針均能特異性結(jié)合胃癌細(xì)胞SGC-7901，孵育120min，探針1的攝取率為13.93±0.45%ID，探針2的攝取率為10.62±0.07%ID，而加入MG7Ab競(jìng)爭(zhēng)性抑制后，細(xì)

10、胞攝取率明顯下降，在孵育60min時(shí)，探針1的攝取率為12.29±0.27%ID，而加入MG7Ab后，攝取率下降至3.85±0.21%ID；探針2在孵育60 min時(shí)攝取率為10.39±0.04%ID，而加入MG7Ab競(jìng)爭(zhēng)后，攝取率下降至3.26±0.04%ID；細(xì)胞親和力測(cè)定得出探針的解離常數(shù)KD=1.15±0.17μM；在體成像顯示探針1較探針2有更好的代謝行為和更佳的成像對(duì)比度，注射后24h，兩種探針在裸鼠腫瘤攝取量分別為2.27

11、±0.54%ID/g和0.25±0.13%ID/g；生物學(xué)分布研究顯示，MG7Ab可競(jìng)爭(zhēng)性抑制探針在腫瘤部位的攝取，在注射后24 h，探針組腫瘤攝取為3.44±0.29%ID/g，而競(jìng)爭(zhēng)抑制組僅為1.01±0.08%ID/g，進(jìn)一步驗(yàn)證了探針結(jié)合的特異性。
　　4.MG7Ab-ICG探針制備與體外、在體成像：
　　通過(guò)共價(jià)耦聯(lián)和非共價(jià)耦聯(lián)兩種方式制備了MG7Ab-ICG探針，紫外-可見(jiàn)光譜吸收顯示，共價(jià)耦聯(lián)探針中，ICG/M

12、G7Ab為5.4，而非共價(jià)耦聯(lián)探針為12.3；光聲成像顯示探針光聲信號(hào)與探針濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)性系數(shù)R2=0.9984；體外穩(wěn)定性檢測(cè)顯示，共價(jià)耦聯(lián)探針的穩(wěn)定性優(yōu)于非共價(jià)耦聯(lián)探針，其在孵育12h、24h和48h的完整度分別為79.6%、75.9%以及72.2%，而非共價(jià)耦聯(lián)探針為31.7%、26.0%以及25.2%，但最終ICG/MG7Ab在兩種探針均在3-4區(qū)間；細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示，孵育2h，探針組細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度為1.37*10

13、6±1.93*105p/s/cm2/sr，競(jìng)爭(zhēng)組為1.04*106±1.05*105p/s/cm2/sr，陰性對(duì)照組為1.07*106±1.28*105p/s/cm2/sr，提示探針可特異性與胃癌細(xì)胞結(jié)合；在體光聲成像顯示 MG7Ab-ICG探針可顯著增強(qiáng)腫瘤區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度，注射2h，探針組信號(hào)為667.3%±102.2%，競(jìng)爭(zhēng)抑制組為339.8±41.3%，信號(hào)強(qiáng)度差別約2倍；近紅外內(nèi)鏡可在探針注射15min區(qū)別腫瘤部位的特異性成像信號(hào)