熒光蛋白分子探針與腫瘤代謝的相關(guān)性成像研究.pdf

1、腫瘤組織的氧化還原狀態(tài)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。腫瘤的異質(zhì)性及其微環(huán)境的特性在一定程度上可以通過檢測其氧化還原代謝狀態(tài)來表征。同時，腫瘤的氧化還原狀態(tài)也影響著抗癌藥物的分布與蓄積。因此，研究腫瘤的氧化還原代謝狀態(tài)對于腫瘤的早期診斷和臨床治療具有重要的意義。
　　煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NADH）和黃素蛋白（Flavoprotein, Fp）是參與線粒

2、體氧化磷酸化的兩種主要輔酶，它們在細胞的能量代謝、線粒體功能、生物合成、基因表達、細胞死亡、腫瘤形成等生命活動過程中發(fā)揮著重要的作用。NADH和Fp的熒光強度值可用于表征組織或細胞的氧化還原狀態(tài)，已經(jīng)成為國際上公認的研究氧化還原狀態(tài)的黃金標準。
　　近年來，熒光蛋白已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物成像的研究中，常用于活細胞內(nèi)標記特定的蛋白分子，研究其空間定位、運動與功能，或于活體內(nèi)標記腫瘤細胞，示蹤腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移與治療效應(yīng)。然而，熒光蛋白在腫

3、瘤內(nèi)的表達及其分布與腫瘤的代謝狀態(tài)之間的相關(guān)性極少報道，尚不清楚腫瘤組織的氧化還原狀態(tài)對腫瘤細胞內(nèi)源性熒光蛋白表達的影響，以及對外源性輸入熒光蛋白探針在腫瘤中分布的影響。
　　本文將從腫瘤代謝狀態(tài)與熒光蛋白表達的相關(guān)性、腫瘤代謝狀態(tài)對熒光蛋白探針分布的影響、以及光敏感蛋白對腫瘤代謝的影響等方面開展系統(tǒng)性的研究。為了在光譜上與組織的自發(fā)熒光(NADH和Fp)區(qū)分開來，本文采用的均是紅色熒光蛋白，以便進行多分子事件的同步多色光學(xué)成像。

4、具體研究結(jié)果如下：
　?。?）為了研究腫瘤生長過程中其氧化還原狀態(tài)與外源性基因表達的相關(guān)性，本研究將深紅色熒光蛋白（far red fluorescent protein, fRFP）轉(zhuǎn)染到三種腫瘤細胞中，篩選穩(wěn)定表達的細胞株并建立了皮下腫瘤動物模型。利用低溫冷凍氧化還原成像系統(tǒng)分別對腫瘤組織進行同步三色成像。發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞增殖快的區(qū)域，其代謝旺盛，即NADH熒光信號增強。腫瘤組織內(nèi)fRFP的熒光強度與NADH的熒光強度呈正相關(guān)(在

5、距離腫瘤表面1-1.5 mm層面，鼻咽癌的R2=0.994；黑色素瘤的R2=0.966；人胰腺癌的R2=0.942)，表明腫瘤組織的氧化還原狀態(tài)與腫瘤細胞熒光蛋白的表達量密切相關(guān)。當(dāng)腫瘤直徑達到5 mm以上，內(nèi)部出現(xiàn)自發(fā)性壞死現(xiàn)象，此區(qū)域轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸栽鰪姷臓顟B(tài)，而腫瘤僅呈現(xiàn)較弱的紅色熒光蛋白信號。
　?。?）為了研究靶向性多肽在腫瘤中的分布情況，本研究以深紅色熒光蛋白fRFP為載體，構(gòu)建了一個靶向整聯(lián)蛋白受體αvβ6的熒光探針Oc

6、ta-RGD，三維成像研究了探針在腫瘤內(nèi)的分布情況。通過實驗發(fā)現(xiàn)該熒光探針對人纖維肉瘤HT1080細胞、鼻咽癌CNE-2細胞、乳腺癌MDA-MB-435S細胞等具有特異性靶向作用。利用本實驗室搭建的低溫冷凍氧化還原成像系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)此探針在腫瘤中的分布與腫瘤的氧化還原代謝狀態(tài)有著一定的相關(guān)性，探針的熒光強度值與腫瘤的氧化還原代謝NADH熒光強度值之間的線性系數(shù)R2=0.793（距離腫瘤表面2200μm層面）。由此判斷此探針更容易進入到腫瘤代

7、謝旺盛的區(qū)域。在此探針的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一個既具有靶向作用又具有治療作用的熒光探針，命名為RGD-GFI。此探針中的抗腫瘤序列是由一段抗菌肽組成，治療結(jié)果證實，此探針對人纖維肉瘤具有明顯的抑制效果。
　?。?）為了研究光動力治療效應(yīng)對腫瘤代謝狀態(tài)的影響，利用目前唯一的光敏感紅色熒光蛋白KillerRed作為光敏劑，進行腫瘤的光動力治療研究。通過代謝成像發(fā)現(xiàn)，在光動力治療過程中，人纖維肉瘤內(nèi)部的氧化還原代謝狀態(tài)被改變。腫瘤組織中的黃素

8、蛋白被氧化，導(dǎo)致了其熒光強度值上升了5.14倍（距離腫瘤表面2200μm層面）。在細胞水平上的研究表明，定位于細胞線粒體的KillerRed蛋白被光照后與未被光照的相比，F(xiàn)p的熒光強度高1.33倍，并具有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.01）。
　　綜上所述，本論文主要進行了腫瘤的氧化還原狀態(tài)成像的研究，檢測了腫瘤在外源基因的表達、靶向性探針的分布、以及光敏感蛋白治療的三種不同條件下的代謝狀態(tài)。利用低溫氧化還原代謝成像系統(tǒng)同時對腫瘤的內(nèi)源性物