基于反義RNA技術(shù)降低發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸中的副產(chǎn)物.pdf

1、3-羥基丙酸(3-HP)性質(zhì)極為活潑，可用于合成多種物質(zhì)。3-HP的微生物發(fā)酵生產(chǎn)是目前研究的熱點(diǎn)，而發(fā)酵的副產(chǎn)物嚴(yán)重影響3-HP的純度及后期的分離純化。本文以肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae為宿主，利用反義RNA技術(shù)，對(duì)副產(chǎn)物做了研究。
　　 1、克隆了K.pneumoniae中的醛脫氫酶基因puuC，連接至表達(dá)載體pET-PK構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-PK-puuC，電擊轉(zhuǎn)化至宿主K.pneumoniae

2、DSM2026，得到重組菌K.p（pET-P K-puuC）。微氧搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明:重組菌3-HP產(chǎn)量為0.86 g/L，較對(duì)照菌K.p(pET-PK)提高了0.21 g/L，甘油轉(zhuǎn)化率和單位菌體產(chǎn)量分別提高了87.5％和61.9％。
　　 2、采用反義RNA技術(shù)，克隆了K.pneumoniae中乳酸產(chǎn)生的關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶基因lldD片段，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-PK-lldD，轉(zhuǎn)化得到重組菌K.p(pET-PK-lldD)。微氧

3、搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明:重組菌中乳酸產(chǎn)量為0.27 g/L，與野生型及攜帶空質(zhì)粒的菌株相比，乳酸的產(chǎn)量分別降低了69％、71％。
　　 3、克隆了K.pneumoniae中乙酸產(chǎn)生的催化酶磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因pta及丙酮酸脫氫酶基因poxB，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-PK-pta，pET-PK-poxB，轉(zhuǎn)化得到重組菌株K.p（pET-PK-pta）、K.p(pET-PK-poxB)。重組菌微氧搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明:K.p(pET-PK-pta

4、)乙酸產(chǎn)量為0.18 g/L，K.p（pET-PK-poxB為0.25 g/L，兩株重組菌比野生菌乙酸產(chǎn)量2.25 g/L分別降低了92％、89％。
　　 4、在pET-PK-lldD質(zhì)粒上分別連入了pta、poxB片段基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-PK-lldD-pta和pET-PK-lldD-poxB(簡(jiǎn)稱(chēng)pET-La、pET-LB)，轉(zhuǎn)化得到重組菌株K.p(pET-La)、K.p(pET-LB)。微氧搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明:K.p(

5、pET-La)中乳酸產(chǎn)量為0.32 g/L，K.p(pET-LB)乳酸產(chǎn)量0.18 g/L，較野生菌分別降低了約65％和80％，K.p(pET-La)、K.p(pET-LB)中乙酸產(chǎn)量均為0.23 g/L，與野生菌相比，分別降低了91％和79％。
　　 5、克隆了來(lái)自大腸桿菌Escherichia coli中的醛脫氫酶基因aldH，連接至已構(gòu)建好的pET-La、 pET-LB質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-La-aldH、pET-LB

6、-aldH，轉(zhuǎn)化得到重組菌K.p(pET-La-aldH)和K.p(pET-LB-aldH)。微氧搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明:K.p(pET-La-aldH)產(chǎn)3-HP1.14 g/L，乳酸0.26 g/L，乙酸0.42 g/L，K.p(pET-LB-aldH)產(chǎn)3-HP1.23 g/L，乳酸0.29 g/L，乙酸0.36 g/L。與野生菌相比，3-HP產(chǎn)量分別提高了44.3％和55.7％，乳酸均降低了約70％，乙酸分別降低了83.1％和85.5