3-羥基丙酸合成途徑的構(gòu)建及優(yōu)化.pdf

1、3-羥基丙酸（3-hydroxypropionic acid，3-HP）因其優(yōu)良的性質(zhì)和廣泛的應(yīng)用前景，被美國(guó)能源部列為全球12大最具潛力的化工產(chǎn)品之一。但目前生物法合成3-HP最主要的問(wèn)題其產(chǎn)量較低，因此開(kāi)發(fā)優(yōu)良的基因工程菌株是目前的主要研究方向。本研究以大腸桿菌（E.coli W3110）為出發(fā)菌株，構(gòu)建了3-HP的合成代謝途徑，并在途徑中敲除了副產(chǎn)物合成的相關(guān)途徑，并引入輔酶再生途徑，構(gòu)建了優(yōu)良的3-HP合成工程菌，并對(duì)工程菌生產(chǎn)

2、3-HP的能力進(jìn)行了探索，具體研究?jī)?nèi)容如下：
　?。?）克隆來(lái)源于K.pneumoniae DSM2026甘油脫水酶基因dhaB及甘油激活因子基因gdrA，得到重組質(zhì)粒pACYCDuet-tac-dhaB1-4質(zhì)粒和pTrc99a-dhaB1-4質(zhì)粒；利用MBTH方法檢測(cè)甘油脫水酶酶活，測(cè)得E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-tac-dhaB1-4甘油脫水酶酶活為2.00 U/mL，比酶活為8.94 U/mg；E

3、.coli BL21(DE3)/pTrc99a-dhaB1-4甘油脫水酶酶活為2.14 U/mL，比酶活為9.59 U/mg?？寺?shí)驗(yàn)室前期突變的巴西固氮螺菌(A.brasilense)的內(nèi)源性基因α-酮戊二酸半醛脫氫酶基因TUkgsadh，得到重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh；測(cè)得E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-tac-TUkgsadh酶活為0.68 U/mL，比酶活為3.11 U/mg。通過(guò)化學(xué)

4、轉(zhuǎn)化法，得到重組菌E.coli BL21(DE3)(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)和E.coli BL21(DE3)(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pTrc99a-dhaB1-4）。上述菌株好氧發(fā)酵35小時(shí)后，3-HP的最高產(chǎn)量分別為1.09 g/L和0.41 g/L。
　?。?）克隆釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的甘油-3-磷

5、酸脫氫酶基因gpd1和大腸桿菌中細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白—吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因sthA。在重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh基礎(chǔ)上，構(gòu)建了輔酶再生的串聯(lián)重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh和pCDFDuet-tac-sthA-TUkgsadh。結(jié)果表明以乙醛為底物時(shí)，E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh和E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-

6、tac-sthA-TUkgsadh的醛脫氫酶的比酶活是E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-tac-TUkgsadh的2.04倍和3.03倍，說(shuō)明輔酶再生基因的表達(dá)有利于提高醛脫氫酶的活性。
　?。?）敲除形成副產(chǎn)物1,3-PDO的主要酶基因—乙醛脫氫酶基因yqhD，得到E.coli W3110_?yqhD(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)，該工程菌搖

7、瓶微好氧發(fā)酵35小時(shí)，3-HP產(chǎn)量達(dá)到4.46g/L，相比未敲除yqhD基因的菌株，其3-HP產(chǎn)量提高了9.42倍。敲除了甘油代謝途徑中的抑制因子glpR基因，得到E.coli W3110_?glpR(pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/pACYCDuet-tac-dhaB1-4)，該工程菌搖瓶微好氧發(fā)酵35小時(shí)，3-HP產(chǎn)量達(dá)到4.02g/L，相比未敲除glpR基因的菌株，其3-HP產(chǎn)量提高了8.40倍。