基于λ-Red重組系統(tǒng)構(gòu)建3-羥基丙酸工程菌.pdf

1、3-羥基丙酸(3-Hydroxypropionic acid，3-HP)是一種多功能高值化學(xué)品?；蚬こ叹l(fā)酵生產(chǎn)3-HP是目前的研究熱點(diǎn)。本研究以耐受高濃度甘油的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae DMS2026)為出發(fā)菌株，構(gòu)建基于串聯(lián)表達(dá)載體和λ-Red同源重組技術(shù)的工程菌，并對(duì)工程菌生產(chǎn)3-HP的能力進(jìn)行了探索，具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　 1、克隆了K.pneumoniae甘油脫水酶基因dhaB和醛

2、脫氫酶基因puuC，構(gòu)建了由甘油脫水酶自身組成型啟動(dòng)子肚調(diào)節(jié)的串聯(lián)表達(dá)載體pET-pk-dhaB-puuC，電擊轉(zhuǎn)化K.pneumoniae DSM2026，獲得重組菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC)，進(jìn)行微氧搖瓶發(fā)酵及上罐發(fā)酵。結(jié)果:微氧搖瓶發(fā)酵15 h后，重組菌的3-HP產(chǎn)量達(dá)到最大值7.2 g/L，分別為野生型K.pneumoniae和K.p(pET-pk)的6.79和8.47倍，副產(chǎn)物乳酸和乙酸濃度也為整個(gè)發(fā)酵周期最低

3、值的0.49 g/L和1.07 g/L;上罐發(fā)酵在維持低副產(chǎn)物水平的同時(shí)，3-HP產(chǎn)量達(dá)到14.2 g/L，因此確定重組菌的最佳發(fā)酵周期為15h。
　　 2、克隆了釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的3-磷酸甘油脫氫酶基因GPD1，在pET-pk-dhaB-puuC基礎(chǔ)上，構(gòu)建了耦合3-HP生產(chǎn)與NAD+再生的串聯(lián)表達(dá)載體pET-pk-dhaB-puuC-GPD1，對(duì)重組菌K.p(pET-pk-dhaB

4、-puuC-GPD1)進(jìn)行微氧搖瓶發(fā)酵。結(jié)果:引入GPD1后，重組菌生物量較K.p(pET-pk-dhaB-puuC)有明顯提升，而3-HP最高值降為1.45 g/L，分別為野生型K.pneumoniae和K.p(pET-pk)的1.93倍和2.39倍，乙酸濃度為發(fā)酵周期最低值0.54 g/L。
　　 3、克隆了λ-Red同源重組系統(tǒng)所需的重組酶基因beta、gam、exo以及上游啟動(dòng)子序列區(qū)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-ParaB-R

5、ed，并成功轉(zhuǎn)化K.pneumoniae DMS2026，得到重組菌K.p(pET-ParaB-Red)。L-阿拉伯糖梯度誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明，在40 mmol/L L-阿拉伯糖誘導(dǎo)90 min后重組酶獲得最佳表達(dá)量。
　　 將連續(xù)三輪易錯(cuò)PCR擴(kuò)增的副產(chǎn)物基因片段lldD、pta、poxB經(jīng)三輪電擊轉(zhuǎn)化至重組菌K.p(pET-ParaB-Red)，通過(guò)高通量篩選獲得了兩株性狀明顯的突變菌株K.pneumoniae(32#)和K.pne

6、umoniae(25#)。搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果:K.pneumoniae(32#)的副產(chǎn)物乙酸和乳酸維持在0.4 g/L以下，而3-HP也持續(xù)低表達(dá)，最高值僅為0.33 g/L。K.pneumoniae(25#)3-HP產(chǎn)量濃度最高達(dá)到0.96 g/L;但在副產(chǎn)物生產(chǎn)上，只能較好地控制乳酸水平(＜0.4 g/L)，而乙酸維持在1.5g/L左右波動(dòng)。此外，測(cè)序結(jié)果表明，兩株菌在核酸及氨基酸水平上都發(fā)生了不同變化;連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)表明，兩株重組菌的