利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸基因工程菌的構建.pdf

1、近年來石化能源的日漸枯遏引發(fā)了人們對新型、可再生能源的深刻思考。生物柴油作為乙醇之后的第二個有望得到大規(guī)模推廣應用的生物能源產(chǎn)品，備受國內外各界的青睞。目前主要通過酯交換法生產(chǎn)生物柴油，在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物--粗甘油廢液。如何合理利用粗甘油廢液，是這一產(chǎn)業(yè)面臨的新問題，尋求粗甘油利用的新途徑已引起人們的普遍關注。本文從上述兩個方面考慮，探索一條利用生物柴油廢液發(fā)酵3-羥基丙酸的生產(chǎn)途徑，不僅可解決生物柴油生產(chǎn)過程中大量副產(chǎn)物甘

2、油的再利用問題，也有望為生物發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸找到另一種新途徑。 本論文研究的主要內容是利用基因工程手段構建以甘油為底物發(fā)酵產(chǎn)3-羥基丙酸的基因工程菌，構建基因工程菌涉及到兩個關鍵酶，即甘油脫水酶(DHAB)和乙醛脫氫酶(ALDH)，甘油首先在甘油脫水酶作用下，脫水轉化成3-羥基丙醛(3-HPA)，然后在乙醛脫氫酶的氧化作用下生成3-羥基丙酸(3-HP)。 本研究首先利用PCR方法從釀酒酵母中克隆到1.9kb的乙醛

3、脫氫酶的編碼基因ALDH及來源于克雷伯氏菌2.7kb的甘油脫水酶的編碼基因DHAB，構建了重組菌E.coliJM109(pUCtac-aldh)和E.coliJM109(pEtac-dhaB)。對重組菌的表達酶活力研究表明：該菌株在37℃下，以1.0mmol/LIPTG誘導5h乙醛脫氫酶活力可達32.6U/mg蛋白，甘油脫水酶活力達到3.3U/mg蛋白。將兩種重組質粒共轉化大腸桿菌E.coliJM109得到重組大腸桿菌E.coliJM1

4、09(pUCtac-aldh,pEtac-dhaB)。對重組菌E.coliJM109、E.coliJM109(pUCtac-aldh)、E.coliJM109(pEtac-dhaB)、E.coliJM109(pUCtae-aldh,pEtac-dhaB)進行發(fā)酵實驗，初步考察該菌利用甘油進行好氧發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的性能。結果表明，E.coliJM109只有同時引入DHAB編碼基因和ALDH編碼基因時才能利用甘油轉化為3-羥基丙酸。在含