缺氧對(duì)HUVECS生物學(xué)特性及VEGFR表達(dá)影響的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:缺氧(Hypoxia)被認(rèn)為是血管形成的關(guān)鍵因素,因?yàn)槿毖鯒l件下可引起血管形成的關(guān)鍵因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)形成。VEGF可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移、增加血管通透性,因此被確認(rèn)為是血管生成的主要原因;而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管型的形成是通過與其相對(duì)應(yīng)特異性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(Vascular endothelial Growt

2、h Factor Receptor,VEGFR)結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)。缺氧對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及生長(zhǎng)因子的作用仍不明確,所以本實(shí)驗(yàn)嘗試研究在缺氧條件下對(duì)培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子以及膜表面受體表達(dá)的變化及其缺氧條件下對(duì)HUVEC生物學(xué)功能的影響。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)以購買HUVEC細(xì)胞株為究對(duì)象,HUVEC細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第三代或第四代備用。

3、分別在缺氧與常氧條件下培臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,比較兩種狀態(tài)下 HUVEC增殖、遷移以及體外管腔能力;免疫熒光染色比較 VEGFR1、VEGFR2蛋白的表達(dá)變化;RT–PCR檢測(cè)兩種條件下VEGF mRNA表達(dá)水平的改變。以上原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩樣本均數(shù)比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多個(gè)樣本兩兩比較先使用方差分析(ANOVA),然后使用多樣本兩兩比較中的SNK法進(jìn)行比較,以 P<0.05表

4、示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、缺氧組與常氧組在24h、48h時(shí)無明顯差異性(P>0.05);在96h,缺氧組和常氧組比較,細(xì)胞的增殖差異明顯(P<0.01),缺氧組的細(xì)胞增殖受到抑制。2、細(xì)胞遷移分析實(shí)驗(yàn)中,常氧組與缺氧組在48小時(shí)的后細(xì)胞遷移面積分析結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),常氧組的細(xì)胞的遷移能力明顯強(qiáng)于實(shí)驗(yàn)組。3、常氧組在48小時(shí)后即能夠形成毛細(xì)血管腔樣結(jié)構(gòu),但缺氧組在48小時(shí)仍未形成管腔樣結(jié)構(gòu)。4、在

5、缺氧組和常氧組HUVEC培養(yǎng)48h后使用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)VEGFR1、VEGFR2,通過檢測(cè)其光密度值檢測(cè)其蛋白的表達(dá)量,其結(jié)果顯示實(shí)缺氧組和常氧組比較VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá)量均有明顯下降( P<0.01),但VEGFR1/VEGFR2值增大(P<0.01)。5、實(shí)驗(yàn)組在0h、12h、24h、48h四個(gè)時(shí)相點(diǎn)分別提取RNA,RT–PCR檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)量, VEGF表達(dá)量在0h和12h時(shí)相點(diǎn)無明顯差異(P>0.05

6、),在24h的時(shí)相點(diǎn)VEGF表達(dá)量開始增加(P<0.05),但24h和48h時(shí)相點(diǎn)表達(dá)量明顯差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:HUVEC在缺氧的作用下表現(xiàn)出了細(xì)胞增殖、遷移、體外管腔形成能力的減低;VEGFR1、VEGFR2蛋白同時(shí)減少的但同時(shí)其比值大幅增加,且VEGF mRNA表達(dá)增加。其結(jié)果表明缺氧時(shí)阻斷VEGF與VEGFR2結(jié)合產(chǎn)生的對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞刺激反應(yīng),保持內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)的穩(wěn)定狀態(tài),以最大限度地保留血管內(nèi)皮細(xì)胞活力和恢復(fù)能力,