GoldMag納米粒對HUVECs生物活性影響及體外MR成像研究.pdf

1、目的：
　　通過對金磁微粒(GoldMag)物理化學(xué)性能進行表征,系列濃度GoldMag標(biāo)記人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),檢測細胞標(biāo)記率、增殖活性、骨架改變、遷移能力,研究GoldMag對HUVECs生物學(xué)活性的影響。GoldMag納米粒及GoldMag標(biāo)記HUVECs磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI),分

2、析不同濃度GoldMag及標(biāo)記HUVECs溶液MRI信號變化規(guī)律和特點,為后期以GoldMag納米粒為載體構(gòu)建MR分子探針進而對腫瘤血管進行靶向分子成像提供一定的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　GoldMag納米粒物理化學(xué)性能表征:(1)透射電子顯微鏡觀察納米粒的形態(tài),測量其粒徑及粒徑分布。(2)用PBS溶液將GoldMag納米粒溶液稀釋到20μg/mL和40μg/mL,DU800UV/VIS分光光度計分別測量G

3、oldMag納米粒溶液的全波長吸收光譜。(3)DU800UV/VIS分光光度計長時間動態(tài)測量濃度為80μg/mLGoldMag納米粒溶液在544nm波長處的吸光度值,評價GoldMag納米粒在PBS溶液中的懸浮穩(wěn)定性。(4)Zeta激光粒度分析儀測量GoldMag納米粒溶液的Zeta電位。
　　GoldMag納米粒標(biāo)記HUVECs及標(biāo)記細胞活性檢測:(1)酶消化法原代分離HUVECs并對其進行傳代培養(yǎng)。(2)采用間接免疫熒光染色對

4、分離的HUVECs進行鑒定,并用流式細胞儀通過直接染色法對其純度進行檢測。(3)0μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL系列濃度GoldMag納米粒溶液與HUVECs共孵育2、4、8、12、24和48h,對標(biāo)記細胞進行普魯士藍染色,觀察納米粒對細胞的標(biāo)記情況并計算不同標(biāo)記時間、不同標(biāo)記濃度對細胞的標(biāo)記率。(4)CCK-8細胞增殖試劑盒檢測系列濃度Gold

5、Mag納米粒溶液標(biāo)記對HUVECs增殖活性的影響。(5)透射電子顯微鏡觀察GoldMag納米粒在HUVECs細胞內(nèi)的標(biāo)記和分布情況。(6)帶FITC熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對GoldMag納米粒標(biāo)記HUVECs進行標(biāo)記,激光共聚焦顯微鏡觀察其細胞骨架的變化。(7)Transwell法、臺盼藍染色法分別觀察GoldMag納米粒標(biāo)記對HUVECs遷移能力及細胞活性的影響。
　　GoldMag納米粒及標(biāo)記HUVECs細胞體外MR成像:(1)對

6、0μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL系列濃度的GoldMag納米粒凝膠溶液進行MR成像檢查,脈沖序列和參數(shù)為FSET1WI、FSET2WI、GRET2*WI、T1mapping、T2mapping,觀察不同濃度GoldMag納米粒的信號變化特點,并測量GoldMag納米粒的T1和T

7、2弛豫時間。(2)對0μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL系列濃度GoldMag納米粒標(biāo)記HUVECs凝膠溶液進行MR成像,脈沖序列及參數(shù)同前,觀察各組細胞溶液的MR信號變化。
　　結(jié)果：
　　GoldMag納米粒物理化學(xué)性能表征:(1)GoldMag納米粒形態(tài)規(guī)則,呈圓形或類圓形,粒徑分布較為集中。隨機選取100個納米粒測量其直徑,經(jīng)計算

8、得到GoldMag納米粒的平均粒徑為49.06±5.24nm。(2)40μg/mL和20μg/mL的GoldMag納米粒溶液均在544nm波長處出現(xiàn)一個小的吸收峰,其吸光度分別為0.1582和0.1206;波長相同時,40μg/mL較20μg/mLGoldMag納米粒溶液的吸光度高。(3)隨著時間的延長,GoldMag納米粒溶液在544nm波長處的吸光度逐漸降低,約4h后其吸光度值趨于穩(wěn)定。GoldMag-PBS分散系具有一定的懸浮穩(wěn)定

9、性,但不是非常穩(wěn)定。(4)GoldMag-PBS分散系的Zeta電位為-18.3±3.2mV。
　　GoldMag納米粒標(biāo)記HUVECs及標(biāo)記細胞生物活性檢測:(1)經(jīng)0.1％(w/v)Ⅰ型膠原酶消化分離得到大量細胞,細胞貼壁生長,排列整齊,生長狀態(tài)良好,梭形,呈典型鋪路石樣。(2)間接免疫熒光染色顯示分離細胞即為HUVECs,流式細胞儀對分離細胞的計數(shù)結(jié)果顯示分離細胞的純度為83.08%。(3)普魯士藍染色顯示隨著標(biāo)記時間、標(biāo)記

10、濃度的增加,HUVECs的標(biāo)記率逐漸升高。(4)CCK-8對標(biāo)記細胞進行增殖活性檢測顯示,GoldMag納米粒溶液濃度≤25μg/mL時,HUVECs的增殖活性影響不大;但濃度逐漸升高時,標(biāo)記細胞的增殖活性出現(xiàn)明顯下降。(5)透射電子顯微鏡下見標(biāo)記HUVECs呈橢圓形、梭形或者不規(guī)則多邊形,細胞結(jié)構(gòu)完整,進入細胞的GoldMag納米粒HUVECs包裹在囊狀的吞噬小泡內(nèi)。(6)激光共聚焦顯微鏡對標(biāo)記HUVECs進行觀察可見,當(dāng)GoldMa

11、g納米粒溶液濃度≤25μg/mL時,細胞骨架無顯著改變,細胞骨架清晰、順暢、紋路分明地分布在細胞中;隨著GoldMag納米粒溶液濃度的進一步增高,細胞骨架開始斷裂、收縮、排列紊亂,骨架的排列明顯變稀疏。(7)細胞遷移實驗顯示,當(dāng)GoldMag納米粒溶液濃度≤25μg/mL時,HUVECs的遷移能力幾乎不受影響;而當(dāng)GoldMag納米粒濃度逐漸升高時,細胞的遷移活性受到明顯影響,遷移至Transwell小室膜下的細胞數(shù)顯著減少。
　

12、　GoldMag納米粒及標(biāo)記HUVECs體外MR成像:(1)GoldMag納米粒凝膠溶液MR成像,在T1WI圖像上,納米粒溶液的信號強度隨著納米粒濃度的增高而呈現(xiàn)一種先輕微升高,而后明顯下降的變化趨勢;在T2WI和T2*WI圖像上,納米粒溶液的信號強度隨著濃度的增高而明顯下降;隨著GoldMag納米粒濃度的逐漸增高,其凝膠溶液的T1、T2弛豫時間都出現(xiàn)明顯的縮短,T2弛豫效能r2為0.51(μg/mL)-1s-1。(2)標(biāo)記HUVECs

13、體外MR成像,隨著GoldMag納米粒濃度的增高,細胞標(biāo)記率逐漸增高,在FSET2WI、GRET2*WI圖像上的信號強度逐漸降低,同時通過T2mapping成像可知,當(dāng)GoldMag納米粒濃度為100μg/mL時,其T2弛豫時間為19.68ms。
　　結(jié)論：
　　(1)GoldMag是一種多功能復(fù)合型納米顆粒,呈圓形或類圓形,粒徑分布均勻,平均粒徑為49.06±5.24nm。在PBS分散系中,GoldMag納米粒具有一定的懸

14、浮穩(wěn)定性,但長時間的靜置會導(dǎo)致GoldMag納米粒逐漸聚集、沉淀。
　　(2)GoldMag能對HUVECs進行體外標(biāo)記,標(biāo)記率呈濃度、時間依耐性,即隨著標(biāo)記濃度的增高、標(biāo)記時間的延長,標(biāo)記陽性率也隨之升高。
　　(3)低濃度GoldMag納米粒溶液(≤25μg/mL)對HUVECs的增殖活性、細胞骨架、細胞活性和遷移能力的影響不顯著,表現(xiàn)出較低的生物學(xué)毒性;當(dāng)濃度逐漸升高時,GoldMag納米粒對HUVECs的增殖活性、細

15、胞骨架改變、細胞活性和遷移能力都有一定的影響。
　　(4)GoldMag納米粒具有較強的弛豫效能,低濃度溶液即能引起顯著的MR信號改變,能夠滿足體外磁共振成像的要求。隨著GoldMag納米粒濃度的增高,其對HUVECs的標(biāo)記效率不斷增高,在T2WI和T2*WI圖像上的信號改變也越來越顯著。
　　(5)GoldMag納米粒溶液能在對細胞安全的濃度范圍內(nèi)對HUVECs進行高效率標(biāo)記,引起足夠的MRI信號改變,證明GoldMag能