熱療對肺癌細胞生物學特性影響的實驗研究.pdf

1、一．熱療對肺癌細胞生長的影響 目的：觀察相同時間內(nèi)不同加熱溫度對人肺癌A549、H1299細胞生長周期及凋亡的影響，探討熱療對表達不同狀態(tài)P53基因肺癌細胞的促凋亡機制。 方法：選取對數(shù)生長期的人肺癌A549、H1299細胞分為實驗組(40℃、42℃、44℃加熱組)和對照組(37℃加熱組)。對照組：分別將人肺癌A549、H1299細胞裝入離心管，37℃水浴放置2h；實驗組：分別將人肺癌A549、H1299細胞放置入離心管

2、中在40℃、42℃、44℃水浴中加熱2h。上述細胞經(jīng)過不同溫度加熱處理后繼續(xù)置入37.0℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法分別檢測不同溫度的熱療對人肺癌A549、H1299細胞生長的抑制作用；流式細胞技術(shù)分別觀察不同溫度的熱療對人肺癌A549、H1299細胞生長周期及凋亡的影響；RT-PCR分別檢測不同溫度的熱療對人肺癌A549、H1299細胞凋亡相關(guān)基因P53、Caspase-3表達的影響。 結(jié)果：①人肺

3、癌A549細胞在加熱至40℃、42℃、44℃維持2h后，細胞生長抑制率分別為：29.0％，47.6％，78.4％；人肺癌H1299細胞在加熱至40℃、42℃、44℃維持2h后，細胞生長抑制率分別為：17.1％，32.2％，69.3％?？梢?，熱療對人肺癌A549、H1299兩種細胞的生長均有抑制作用，隨加熱溫度的升高兩種細胞生長受抑制的程度越強，加熱后A549細胞的生長抑制率明顯高于H1299細胞。②人肺癌A549細胞在加熱至37℃、40

4、℃、42℃、44℃，各維持2h后，G0/G1期細胞的比例分別為：67.842±1.463％，62.173±1.324％，52.871±0.539％，54.983±1.217％；凋亡率分別為：0.505±0.109％，5.812±1.356％，14.249±0.499％，10.315±1.162％。人肺癌H1299細胞在加熱至37℃、40℃、42℃、44℃，各維持2h后，G0/G1期細胞的比例分別為：64.196±1.324％，64.74

5、3±0.979％，62.985±2.364％，63.623±1.657％；凋亡率為：0.593±0.247％，4.918±1.326％，10.454±0.473％，9.285±0.321％?？梢?，熱療可以明顯改變?nèi)朔伟〢549細胞生長周期的分布，G0/G1期細胞明顯減少，并以42℃加熱時G0/G1期細胞減少最為明顯。但是，加熱對人肺癌H1299細胞生長周期的分布影響不大。不同溫度加熱后A549細胞的凋亡率明顯高于H1299細胞，并以42

6、℃時凋亡率最高。③40℃、42℃、44℃的熱療后A549細胞P53蛋白的表達明顯增強，并以42℃加熱組P53蛋白的表達最為明顯；加熱并不能誘導H1299細胞P53蛋白的表達。然而，40℃、42℃、44℃的熱療能同時誘導A549、H1299兩種細胞Caspase-3蛋白表達的增強，不同溫度加熱后A549細胞Caspase-3蛋白的表達均高于H1299細胞，并且以A549細胞、42℃加熱組中Caspase-3蛋白的表達最強。 結(jié)論：

7、①熱療能明顯抑制肺癌細胞的生長，并且隨加熱溫度的升高細胞生長受抑制的程度增強。②熱療可以通過抑癌基因P53途徑改變肺癌細胞的生長周期，使其阻滯在G0/G1期，并且最終通過激活Caspase-3誘導細胞凋亡。③在肺癌細胞熱療過程中，以42℃加熱2h對肺癌細胞生長周期及凋亡的影響最大。二.熱療對肺癌A549細胞免疫應(yīng)答的影響目的：觀察相同時間內(nèi)不同加熱溫度對人肺癌A549細胞表面共刺激分子B7-H1(PD-L1）、B7-H3以及熱休克蛋白H

8、SP-70表達的影響，探討共刺激分子B7-H3以及熱休克蛋白HSP-70在熱療后的腫瘤免疫中可能發(fā)揮的作用。方法：選取對數(shù)生長期的人肺癌A549細胞分為實驗組(40℃、42℃、44'C加熱組)和對照組(37℃加熱組)。對照組：將人肺癌A549細胞裝入離心管，37℃水浴放置2h；實驗組：將人肺癌A549細胞放置入離心管中在40℃、42℃、44℃水浴中加熱2h。上述細胞經(jīng)過不同溫度加熱處理后繼續(xù)置入37.0℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。采用流式細胞

9、技術(shù)觀察不同溫度的熱療對人肺癌A549細胞表面PD-L1，B7-H3表達的影響；免疫組織化學方法檢測不同溫度加熱處理后A549細胞中HSP-70的表達。結(jié)果：①肺癌A549細胞在加熱至37℃、40℃、42℃、44℃，各維持2h后，細胞中B7-H3的表達分別為；0.8％，90.7％，97.3％，86.0％；而人肺癌A549細胞在加熱至37℃、40℃、42℃、44℃，各維持2h后，細胞中PD-L1的表達分別為：0.6％，0.6％，0.7％，

10、0.9％，均為陰性表達?？梢?，熱療能夠明顯上調(diào)人肺癌A549細胞表面B7-H3的表達，并且以42℃加熱組中B7-H3的表達量最高；但熱療不能改變A549細胞表面的PD-L1的表達。②37℃組HSP-70在A549細胞中呈陰性表達，40℃、42℃、44℃的熱療能夠使A549細胞中的HSP-70呈陽性表達；并且以42℃加熱組中HSP-70呈強陽性表達；在44℃加熱組中HSP-70雖然也呈強陽性表達，但大部分細胞的細胞核固縮，細胞出現(xiàn)壞死。