木果楝檸檬苦素的質(zhì)譜分析與抗抑郁研究.pdf

1、在發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物用于開發(fā)具有治療人類疾病的藥物過程中，天然產(chǎn)物具有主導(dǎo)地位。事實(shí)上，植物和微生物的藥理活性成分是新藥研發(fā)的重要途徑。木果楝（Xylocarpus granatum Koenig）具有多種活性，并且近年被廣泛證明。但是對(duì)其抗抑郁活性的研究未見報(bào)道。快速、靈敏的質(zhì)譜技術(shù)在天然產(chǎn)物中的應(yīng)用越來越廣泛，且質(zhì)譜裂解規(guī)律有助于快速識(shí)別并解析化合物的結(jié)構(gòu)，而對(duì)已知物去重復(fù)，進(jìn)而探索未知化合物進(jìn)行深入研究。目前，關(guān)于木果楝中含有獨(dú)特結(jié)構(gòu)

2、的檸檬苦素的質(zhì)譜研究還鮮有報(bào)道。因此，本研究運(yùn)用質(zhì)譜方法對(duì)木果楝檸檬苦素類成分進(jìn)行鑒定和定量的快速識(shí)別，并對(duì)木果楝檸檬苦素的抗抑郁活性進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)研究，本研究為從木果楝中快速發(fā)現(xiàn)新的化合物及鑒定和質(zhì)量控制木果楝奠定基礎(chǔ)，為從木果楝檸檬苦素中發(fā)現(xiàn)具有抗抑郁活性先導(dǎo)化合物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分：木果楝檸檬苦素的質(zhì)譜鑒定
　　目的：
　　通過分析木果楝檸檬苦素的二級(jí)質(zhì)譜（Q-TOF-MS/MS），探索其質(zhì)譜裂解途徑，

3、總結(jié)裂解規(guī)律。運(yùn)用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）對(duì)木果楝檸檬苦素類化合物進(jìn)行鑒定。
　　方法：
　　1.UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析條件：Kinetex-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm,2.6μm），柱溫：40℃。流動(dòng)相：A為乙腈，B為水-0.1％甲酸-1 mM乙酸銨溶液。梯度洗脫，洗脫程序如下：10%A(0~5 min)；10-30%A(5~10 min)；3

4、0-35%A(10~20 min)；35-50%A(20~35 min)；50-95%A(35~45 min)；95%A(45~50 min)。流速：0.4 mL/min。進(jìn)樣量：2μL。DuoSpray電噴霧離子（ESI）源；離子源溫度（turbo spray temperature）：600℃。氣簾氣（CUR）：35 psi；霧化氣（Gas1）：50 psi；加熱氣（Gas2）：50 psi；在正離子模式下，噴霧電壓（ionspra

5、y voltage）為5500 V，解簇電壓（DP）為80 V。信息相關(guān)采集模式，包括TOF-MS探測(cè)掃描100-1000 Da（200 ms）和最多8個(gè)依賴的TOF-MS/MS掃描50-1000 Da（100 ms），碰撞能量為35 eV，碰撞擴(kuò)展能量為±15 eV。
　　2.鑒定策略：經(jīng)驗(yàn)分子式的計(jì)算和碎片離子的預(yù)測(cè)使用PeakView?軟件完成。通過與對(duì)照品比較保留時(shí)間、精確質(zhì)量和MS/MS質(zhì)譜，明確鑒定已知化合物?；谫|(zhì)譜

6、裂解規(guī)律、精確質(zhì)量、保留時(shí)間和植物化學(xué)文獻(xiàn)，初步鑒定已知化合物和推測(cè)鑒定未知化合物。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用Q-TOF-MS/MS分析并總結(jié)了17個(gè)木果楝檸檬苦素的質(zhì)譜裂解規(guī)律。這些裂解規(guī)律主要包括，丟失?；蝓Ｑ趸鶄?cè)鏈、丟失水分子及CO分子。
　　2.應(yīng)用UHPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定了木果楝檸檬苦素類化合物。從木果楝果實(shí)提取物中檢測(cè)到了至少300個(gè)化合物。通過與對(duì)照品對(duì)比，明確鑒定了17個(gè)已知化合物。初步

7、鑒定了116個(gè)化合物。鑒定了7個(gè)潛在的新化合物。
　　結(jié)論：
　　1.首次系統(tǒng)的研究了17個(gè)木果楝檸檬苦素的質(zhì)譜裂解規(guī)律。
　　2.UHPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定了木果楝檸檬苦素類化合物。基于對(duì)照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律、植物化學(xué)文獻(xiàn)，推測(cè)鑒定了木果楝果實(shí)中的檸檬苦素類化合物。UHPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定木果楝檸檬苦素簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、專屬性好。鑒定這些化合物為進(jìn)一步研究木果楝中檸檬苦素類化合物的植物

8、化學(xué)、代謝物鑒定和質(zhì)量控制提供了重要依據(jù)。
　　第二部分：木果楝檸檬苦素的質(zhì)譜定量測(cè)定
　　目的：
　　開發(fā)和驗(yàn)證一種化學(xué)計(jì)量學(xué)輔助的LC-MS/MS方法用于測(cè)定17種檸檬苦素，揭示木果楝果實(shí)不同部位檸檬苦素的化學(xué)組成與分布。
　　方法：
　　1.LC-MS/MS分析條件：17個(gè)分析物的LC分離在40℃的PhenomenexKinetex柱（XB-C18,100 mm×2.1 mm,2.6μm）中進(jìn)行，使用

9、5μL進(jìn)樣體積。流動(dòng)相由乙腈（A）和0.1%（v/v）甲酸（B）組成，流速為300μL/min。以下梯度程序用于定量：0.0-1.0 min，45-55%A；1.0-4.0 min，55-60%A；4.0-5.0 min，60-95%A；5.0-10.0 min，95%A；10.0-11.0 min，95-45%A。ESI噴霧電壓為5500 V，正離子模式監(jiān)測(cè)，噴霧溫度為600℃。氣簾氣、霧化氣體（Gas1）和加熱器氣體（Gas2）分別

10、設(shè)置在30、50和55 psi。在所有情況下使用氮?dú)?。預(yù)設(shè)的MRM算法用于在90 s的MRM檢測(cè)窗口和0.7 s的目標(biāo)掃描時(shí)間，在預(yù)期的保留時(shí)間監(jiān)測(cè)34個(gè)離子對(duì)（每個(gè)化合物2個(gè)離子對(duì)）。在增強(qiáng)產(chǎn)物離子（enhanced product ion，EPI）模式中，信息相關(guān)采集（information dependent acquisition,IDA）掃描觸發(fā)相關(guān)的MS/MS質(zhì)譜掃描以便更好地確認(rèn)被測(cè)物。將完整的分子指紋信息保存在EPI譜中

11、，顯著降低假陽性和陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。使用35 eV的標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能（collision energy，CE）以15 eV的擴(kuò)展碰撞能量在4000 Da/s的掃描速度下產(chǎn)生EPI質(zhì)譜。IDA設(shè)置中，選擇響應(yīng)信號(hào)最高的前體離子（質(zhì)量差異范圍為250 mDa），每個(gè)探測(cè)掃描都扣除動(dòng)態(tài)背景，信號(hào)閾值為100 cps。應(yīng)用MasterView?軟件進(jìn)行EPI鑒定，純度值設(shè)置在大于等于70%為陽性結(jié)果。常規(guī)MRM與預(yù)設(shè)MRM相比，駐留時(shí)間是唯一的不同參

12、數(shù)，它用20 ms替換了每對(duì)離子的監(jiān)測(cè)時(shí)間窗口。
　　2.對(duì)預(yù)設(shè)MRM LC-MS/MS方法進(jìn)行驗(yàn)證，包括，線性、最低檢測(cè)限、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率和基質(zhì)效應(yīng)。響應(yīng)面優(yōu)化方法用于優(yōu)化超聲輔助提取。主成分分析（principal component analysis,PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA

13、）用于分析LC-MS/MS數(shù)據(jù)，可提供化學(xué)計(jì)量學(xué)模型用于簡(jiǎn)便的可視化和解釋木果楝果實(shí)不同部位的差異。
　　結(jié)果：
　　1.本研究中，開發(fā)和驗(yàn)證了化學(xué)計(jì)量學(xué)輔助的LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定木果楝果實(shí)不同部位的17種檸檬苦素。與常規(guī)MRM相比，預(yù)設(shè)MRM提高了靈敏度和精度。預(yù)設(shè)MRM LC-MS/MS方法得到了良好的驗(yàn)證，包括，線性（R>0.99）、最低檢測(cè)限（0.20-10.0 ng/mL）、精密度（日內(nèi)1.2%-7.6%和日

14、間1.1%-2.6%）、重復(fù)性（2.1%-6.9%）、穩(wěn)定性（4.3%-7.2%）、回收率（88.2%-106.2%）和基質(zhì)效應(yīng)（90.1%-103.3%）。
　　2.通過RSM獲得的最優(yōu)超聲輔助提取條件比一般單次單因素法更準(zhǔn)確。該方法用于分析35批木果楝果實(shí)不同部位的檸檬苦素。所有17種檸檬苦素顯示明顯的排序，種仁>種子>果實(shí)；13種檸檬苦素顯示另一種排序，種仁>種子>果實(shí)>果皮>種皮?；贚C-MS/MS數(shù)據(jù)的PCA和OPLS

15、-DA分析，確定了木果楝果實(shí)不同部分分類的潛在化學(xué)標(biāo)記物。
　　結(jié)論：
　　本研究中，為了揭示木果楝果實(shí)不同部位檸檬苦素的化學(xué)成分組成與分布，開發(fā)和驗(yàn)證了化學(xué)計(jì)量學(xué)輔助的LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定17種檸檬苦素。另外，本研究表明針對(duì)LC-MS/MS進(jìn)行多組分定量的開發(fā)、優(yōu)化和數(shù)據(jù)分析，由RSM，PCA和OPLS-DA組成的化學(xué)計(jì)量學(xué)輔助的綜合策略是有效和可行的。此外，本研究提供了鑒定和質(zhì)量控制木果楝果實(shí)作為民間藥物的化學(xué)成分

16、組成與分布的證據(jù)。
　　第三部分：木果楝檸檬苦素的抗抑郁活性初步實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：
　　研究木果楝檸檬苦素在急性應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠抑郁模型中潛在的抗抑郁活性和作用機(jī)制。
　　方法：
　　通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究木果楝檸檬苦素xylocarpin H、cipadesin A和xyloccensin K的抗抑郁活性，通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)研究其潛在的作用機(jī)制。木果楝檸檬苦素xylocarpin H、cipadesin A和

17、xyloccensin K的抗抑郁活性（5,15,50 mg/kg/day for7days, intragastrically）通過強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。通過酶免疫法測(cè)定血清皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素，評(píng)價(jià)xylocarpin H和cipadesin A對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺軸的作用。
　　結(jié)果：
　　木果楝檸檬苦素能顯著降低小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的漂浮不動(dòng)時(shí)間（xylocarpin H、cipadesin A和

18、xyloccensin K在15-50 mg/kg），顯著降低小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)中懸尾不動(dòng)時(shí)間（xylocarpin H和 cipadesin A在15-50 mg/kg，xyloccensin K在5-50 mg/kg）。木果楝檸檬苦素顯著增加小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間（xylocarpin H在5-50 mg/kg，cipadesin A在15-50 mg/kg，xyloccensin K在50 mg/kg），并且不影響自發(fā)活動(dòng)

19、。另外，重復(fù)給予xylocarpin H和cipadesin A顯著降低了處于強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)小鼠血清中皮質(zhì)酮CORT（xylocarpin H在15-50 mg/kg，cipadesin A在5-50 mg/kg）和促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH（xylocarpin H和cipadesin A在15-50 mg/kg）的水平，但對(duì)于未經(jīng)應(yīng)激處理的小鼠無影響。
　　結(jié)論：
　　木果楝檸檬苦素xylocarpin H、cipadesi