橘籽中檸檬苦素的提取工藝研究【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　（20 屆）</b></p><p>　　橘籽中檸檬苦素的提取工藝研究</p><p><b>　　專業(yè)：應(yīng)用化學(xué)</b></p><p>　　摘要：本論文采用高效液相色譜法(HPLC)利用正交設(shè)

2、計(jì)實(shí)驗(yàn)來確定橘籽中提取檸檬苦素的最佳工藝條件。結(jié)果顯示：最大限量提取檸檬苦素的最佳實(shí)驗(yàn)條件是：反應(yīng)溫度為70℃，提取時(shí)間為4小時(shí)，液料比為1g：80mL。關(guān)鍵詞：高效液相色譜法(HPLC)；橘籽；正交設(shè)計(jì)；檸檬苦素</p><p>　　The extraction process of limonin from orange seeds</p><p>　　Abstract: In th

3、is study, we used the orthogonal experimental design, using high performance liquid chromatography (HPLC) to determine some of the best conditions of extraction of Limonin briefly. Based on the experimental data, we can

4、obtain that the temperature of extraction can be controlled at around 70℃, the time can be controlled in 5 hours, and liquid ratio can be controlled in 1:80(g/mL).</p><p>　　Key words: high performance liquid

5、 chromatography (HPLC); orange seeds; limonin; orthogonal</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　1.1檸檬苦素的簡介1</p><p>　　1.2檸檬苦素的作用

6、1</p><p>　　1.2.1 檸檬苦素的抗癌作用1</p><p>　　1.2.2 檸檬苦素在柑桔化學(xué)分類上的作用2</p><p>　　1.3檸檬苦素的檢測方法2</p><p><b>　　2.實(shí)驗(yàn)部分2</b></p><p>　　2.1 儀器與試劑2</p>

7、<p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器2</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑3</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)原理3</p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)步驟3</p><p>　　2.3.1 繪制檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線3</p><p>　　2.3.2 設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)表3</p><p

8、>　　2.3.3 檸檬苦素的提取4</p><p>　　2.3.4 檸檬苦素的檢測4</p><p><b>　　3.結(jié)果與分析4</b></p><p>　　3.1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖5</p><p>　　3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制5</p><p>　　3.3實(shí)驗(yàn)樣品的

9、HPLC檢測6</p><p>　　3.4 數(shù)據(jù)處理12</p><p>　　3.5 結(jié)果分析14</p><p><b>　　4 展望14</b></p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1 引言</b></p>&l

10、t;p>　　1.1檸檬苦素的簡介</p><p>　　檸檬苦素類化合物主要存在于蕓香科植物果實(shí)中，如枳實(shí)（臍橙、柑桔、香橙）柚等中。以果核（種子）中含量較高，果皮中含量較少（約萬分之一至十萬分之五）。柑桔中的類檸檬苦素存在兩種形式，一種為類檸檬苦素配基化合物，已分離鑒定出37種[1]，另一種為類檸檬苦素葡萄搪苷化合物，已分離鑒定出21種[2]。</p><p>　　檸檬苦素的分子式：

11、C26H30O8；分子結(jié)構(gòu)如圖1-1所示：</p><p>　　圖1-1檸檬苦素的分子結(jié)構(gòu)</p><p>　　最新研究表明柑橘中的三萜類物質(zhì)在抗腫瘤方面有相當(dāng)好的成效，檸檬苦素(1imonin)及其類似物就是其中一類重要組分[3]。檸檬苦素及其類似物在抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、改善睡眠、抗病毒、抗菌、利尿、抗焦慮，調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇含量、防止動(dòng)脈粥樣硬化和除蟲等方面都具有顯著效果[4]。日本、美國

12、已報(bào)道了檸檬苦素類物質(zhì)制作功能性食品和飲料的專利[5]，檸檬苦素的應(yīng)用前景極為可觀。目前，檸檬苦素主要采用熱提取、浸泡提取及超臨界萃取等提取方法從天然植物中提取，研究人員已經(jīng)成功從蕓香科和楝科的多種植物中提取出檸檬苦素及其類似物[6]。由于熱提取和浸泡提取檸檬苦素，需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和不必要的溶劑浪費(fèi)，而且，在提取檸檬苦素的過程當(dāng)中，脫脂和提取過程中所需要的溶劑對(duì)人體健康又有影響，而對(duì)于用超臨界萃取的提取方法來說，節(jié)省了時(shí)間與溶劑的用量

13、，并且無污染。然而，對(duì)于現(xiàn)階段的科技發(fā)展，超臨界萃取的方法，無法得到廣泛的應(yīng)用。因此，對(duì)于如何在最有效的時(shí)間，用最合適的溶劑和溶劑用量及盡最大限度來控制提取過程中溶劑對(duì)人體健康的影響的研究，顯得越來越重要。</p><p>　　1.2檸檬苦素的作用</p><p>　　1.2.1 檸檬苦素的抗癌作用</p><p>　　1989年Lam[7]等用柑桔類檸檬苦素在小鼠

14、上做試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)類檸檬苦素能誘導(dǎo)GST（谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶）的活性，能抑制化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的腫瘤的發(fā)生。其中諾米林在肝臟和小腸粘膜的誘導(dǎo)性最高，檸堿的誘導(dǎo)作用較弱。檸堿和諾米林對(duì)BP誘導(dǎo)ICR4Ia小鼠前胃癌的抑制作用試驗(yàn)，結(jié)果表明，諾米林劑量為10mg時(shí)，其腫瘤數(shù)量減少50%，諾米林抗癌效果優(yōu)于檸堿。Miller[8]等研究發(fā)現(xiàn)，口服檸堿(2.5%)的田鼠，可使DMBA誘導(dǎo)TPA促進(jìn)的口腔癌腫瘤數(shù)量減少20%，重量減少50%。諾米林對(duì)DMBA

15、誘導(dǎo)的癌癥的抑制作用不如檸堿。他們還發(fā)現(xiàn)，檸堿在皮膚癌促進(jìn)期的抑制作用優(yōu)于諾米林，而諾米林恰好相反，在起始階段抑制作用強(qiáng)。Miller[9]等發(fā)現(xiàn)葡萄糖苷有相同的化學(xué)抑制活性，對(duì)DMBA誘導(dǎo)的田鼠皮膚癌有抑制作用，檸堿葡萄糖苷3.5%濃度下表現(xiàn)出對(duì)動(dòng)物平均腫瘤負(fù)擔(dān)下降55%，并且高于諾米林葡萄糖苷和諾米林酸葡萄糖苷，類檸檬苦素抗癌的機(jī)理還在進(jìn)一步探討中，大多數(shù)研究人員認(rèn)為與其結(jié)構(gòu)中的吠喃環(huán)有很大關(guān)系。</p><p&

16、gt;　　1.2.2 檸檬苦素在柑桔化學(xué)分類上的作用</p><p>　　類檸檬苦素為柑桔次生代謝產(chǎn)物之一，特征性的類檸檬苦素及其生物合成途徑只在特定的種或?qū)僦写嬖?，每一栽培品種的類檸檬苦素含量模型是唯一的[10]。從柑桔植物的分布情況看，純種的柑桔亞屬由寬皮柑桔、袖和枸椽等3個(gè)原種與它們的雜交種構(gòu)成(按照施文格分類法)。由于蕓香科金柑屬、宜昌橙、積屬植物與柑桔雜交，產(chǎn)生了許多雜交種。這些雜交種除含有檸堿群外，還

17、含有各自的特征化合物，通過分析這些化合物，可以推測出雜交種的親本，而且分析柑桔及其近緣植物的類檸檬苦素，對(duì)于評(píng)價(jià)己有分類系統(tǒng)及培育新的雜交種，篩選優(yōu)良柑桔和品種鑒定具有重要意義。</p><p>　　1.3檸檬苦素的檢測方法</p><p>　　經(jīng)過多年的研究，檸檬苦素類化合物的分析方法仍存在許多技術(shù)問題。如缺少對(duì)檸檬苦素類化合物的快速定量的檢測方法及商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；該類化合物成分復(fù)雜，難以分離

18、；所以建立一種能夠有效分析該類物質(zhì)的方法一直是科學(xué)工作者為之奮斗的目標(biāo)。目前常用的方法有：</p><p>　?。?）薄層色譜法（TCL）</p><p>　?。?）分光光度法（UV）</p><p>　?。?）高效液相色譜法（HPLC）</p><p>　　其中HPLC方法因其良好的精密度、重現(xiàn)性和普遍性成為檸檬苦素類化合物最常用的分析方法

19、。Rouseff和Fisher[11]建立了正相高效液相色譜法，采用CN基鍵合硅膠柱和正己烷、異丙醇、甲醇的三元體系，有效分離奧巴叩酮、諾米林、檸檬苦素和脫氧諾米林等4種苷元。Hasegawa和Manners[12]使用微球硅膠柱和環(huán)己烷、四氫吠喃的二元體系分離檸檬苦素類化合物苷元，該方法的高選擇性已經(jīng)達(dá)到商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)的研究選擇了利用高效液相色譜法進(jìn)行高精密度的檢測，來確定提取檸檬苦素的

20、各方面的工藝參數(shù)，從而為檸檬苦素的研究發(fā)展提供有力的依據(jù)。</p><p><b>　　2.實(shí)驗(yàn)部分</b></p><p><b>　　2.1 儀器與試劑</b></p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器</p><p>　　島津LC-20AT型高效液相色譜儀、SH2-D3型予華牌循環(huán)水蒸空泵（鞏

21、義市予華儀器有限公司）、85-1水浴磁力攪拌器 (杭州儀表電機(jī)有限公司)、RE301(3L)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (河南一恒儀器有限公司)</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑</p><p>　　所用實(shí)驗(yàn)試劑如表2-1表示：</p><p><b>　　表2-1 實(shí)驗(yàn)試劑</b></p><p><b>　　2.2

22、 實(shí)驗(yàn)原理</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)以橘籽為原料，將其曬干，研磨成粉末用石油醚（60℃～90℃）進(jìn)行脫脂，烘干。再將脫脂后烘干的橘子粉末用丙酮作為提取液在水浴磁力攪拌器中進(jìn)行提取，將提取液通過HPLC判斷檸檬苦素的含量，以確定提取檸檬苦素的最佳工藝流程。</p><p><b>　　2.3 實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p>

23、;　　2.3.1 繪制檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　精密稱取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品0.0010g，用丙酮作為溶劑，分別制取8種不同濃度的檸檬苦素溶液，標(biāo)記為1、2、3、4、5、6、7、8。精密量取10μL的8種溶液分別注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。</p><p>　　2.3.2 設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)表</p>&

24、lt;p>　　采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，做出正交試驗(yàn)表，本試驗(yàn)選擇L16(43)正交表，具體實(shí)施方案詳見表2-2。</p><p>　　表2-2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃表</p><p>　　2.3.3 檸檬苦素的提取</p><p>　?。?）取適量橘籽，將其研磨成粉末，稱取一定量的桔籽粉末，加入適量石油醚，在恒溫水浴鍋內(nèi)進(jìn)行脫脂：溫度70℃左右，時(shí)間在3～５小時(shí)之間。再

25、將脫脂后的桔籽粉末混合溶液進(jìn)行抽慮，剩下脫脂后的桔籽粉末，再放置于烘箱進(jìn)行烘干，溫度不宜太高，較室溫高一點(diǎn)就行。</p><p>　　（2）準(zhǔn)確稱取16份質(zhì)量均為1g的脫脂后的桔籽粉末，標(biāo)記。</p><p>　?。?）按正交設(shè)計(jì)中的要求加入定量的丙酮，在磁力水浴攪拌器中進(jìn)行水浴加熱提取。</p><p>　?。?）將加熱后的溶液冷卻，再通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋蒸，將部

26、分丙酮蒸發(fā)，以取得較精確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。</p><p>　　2.3.4 檸檬苦素的檢測</p><p>　　首先確定色譜條件：用體積比為45:55的乙腈-水做為流動(dòng)相，流速為1mL/min，柱溫為常溫，檢測波長為210nm。將16份已標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)樣品，各提取10μL，注入高效液相色譜儀，以標(biāo)準(zhǔn)檸檬苦素樣品為指標(biāo)進(jìn)行HPLC測定。</p><p><b>　　3

27、.結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖 </p><p>　　從圖3-1可知，標(biāo)準(zhǔn)樣品中檸檬苦素的保留時(shí)間為9.692min。</p><p>　　圖3-1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖</p><p>　　通過對(duì)不同溶度的標(biāo)準(zhǔn)檸檬苦素溶液樣品進(jìn)行進(jìn)樣，得到如表3-1所示的檸檬苦素濃度與峰面積間的對(duì)

28、應(yīng)關(guān)系。</p><p>　　表3-1 標(biāo)準(zhǔn)樣品中檸檬苦素濃度與峰面積間的相應(yīng)值</p><p>　　3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制</p><p>　　通過標(biāo)準(zhǔn)樣品中檸檬苦素的度與峰面積之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系如表3-1，根據(jù)峰面積(Y)對(duì)其質(zhì)量濃度(X, mg/L)回歸分析。得到圖3-2所示的檸檬苦素的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。其中，橫坐標(biāo)是檸檬苦素的濃度，縱坐標(biāo)為峰面積。</p&g

29、t;<p>　　圖3-2 檸檬苦素的標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　由圖3-2可知，檸檬苦素峰面積Y間滿足關(guān)系式：Y=8524.3X+7359.7；方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9996；二者間線性關(guān)系良好。</p><p>　　3.3實(shí)驗(yàn)樣品的HPLC檢測</p><p>　　通過保留時(shí)間對(duì)樣品中所含檸檬苦素進(jìn)行定性，每個(gè)樣品平均進(jìn)樣3次，所測保留時(shí)間在9.

30、69min左右。通過樣品中的檸檬苦素的峰面積和濃度之間的關(guān)系式：Y=8524.3X+7359.7；定量測定檸檬苦素的含量。</p><p>　　在60℃；丙酮用量40mL；水浴3h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為979663，出峰時(shí)間在9.682min，如圖3-3所示：</p><p>　　圖3-3檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在60℃；丙酮用量60mL；水浴

31、4h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為861509，出峰時(shí)間在9.663min，如圖3-4所示：</p><p>　　圖3-4檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在60℃；丙酮用量80mL；水浴5h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為553209，出峰時(shí)間在9.683min，如圖3-5所示：</p><p>　　圖3-5檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p&g

32、t;　　在60℃；丙酮用量100mL；水浴6h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為499709，出峰時(shí)間在9.686min，如圖3-6所示：</p><p>　　圖3-6檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在65℃；丙酮用量40mL；水浴4h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為,584906，出峰時(shí)間在9.665min，如圖3-7：</p><p>　　圖3-7檸檬苦素的高效液相色譜

33、圖</p><p>　　在65℃；丙酮用量60mL；水浴3h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為,1107416，出峰時(shí)間9.684min，如:3-8所示：</p><p>　　圖3-8檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在65℃；丙酮用量80mL；水浴6h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為694156，出峰時(shí)間在9.627min，如圖3-9所示：</p><p

34、>　　圖3-9檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在65℃；丙酮用量100mL；水浴5h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為640698，出峰時(shí)間在9.667min，如圖3-10所示：</p><p>　　圖3-10檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在70℃；丙酮用量40mL；水浴5h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為840945，出峰時(shí)間在9.693min，如圖

35、3-11所示：</p><p>　　圖3-11檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在70℃；丙酮用量60mL；水浴6h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為527990，出峰時(shí)間在9.667min，如圖3-12所示：</p><p>　　圖3-12檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在70℃；丙酮用量80mL；水浴3h時(shí)，檸檬苦素的峰面積

36、為914759，出峰時(shí)間在9.699min，如圖3-13所示：</p><p>　　圖3-13檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在70℃；丙酮用量100mL；水浴4h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為441652，出峰時(shí)間在9.698min，如圖3-14所示：</p><p>　　圖3-14檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在75

37、℃；丙酮用量40mL；水浴4h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為618746，出峰時(shí)間在9.701min，如圖3-15所示：</p><p>　　圖3-15檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在75℃；丙酮用量60mL；水浴3h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為2523889，出峰時(shí)間在9.656min，如圖3-16所示：</p><p>　　圖3-16檸檬苦素的高效液相色譜圖&

38、lt;/p><p>　　在75℃；丙酮用量80mL；水浴4h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為784514，出峰時(shí)間在9.636min，如圖3-17所示：</p><p>　　圖3-17檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在75℃；丙酮用量100mL；水浴5h時(shí)，檸檬苦素的峰面積為1400850，出峰時(shí)間在9.628min，如圖3-18所示：</p><

39、;p>　　圖3-18檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p><b>　　3.4 數(shù)據(jù)處理</b></p><p>　　經(jīng)過高效液相色譜儀（HPLC）檢測，得出各組分樣品的峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（Y=8524.3X+7359.7）計(jì)算出檸檬苦素的濃度，根據(jù)m=c*V，得出樣品中所含檸檬苦素的質(zhì)量。列表如下：</p><p>　　表3

40、-2 峰面積與質(zhì)量的對(duì)應(yīng)列表</p><p>　　通過檢測出來的峰面積，根據(jù)檸檬苦素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得出相應(yīng)的濃度。同時(shí)測出所要檢測樣品的體積，測出樣品中所含檸檬苦素的質(zhì)量：</p><p>　　表3-3 正交設(shè)計(jì)表</p><p><b>　　3.5 結(jié)果分析</b></p><p>　　根據(jù)參考文獻(xiàn)，選取了最有對(duì)比性的影

41、響因素以及各影響因素的水平范圍，經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)，得出各組分?jǐn)?shù)據(jù)，最后利用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，選擇最佳提取工藝，并與文獻(xiàn)中的方法以及它的工藝作對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)，通過正交得到的最佳條件，縮短了最佳提取時(shí)間，降低了最佳提取溫度范圍，調(diào)整了最佳提取液料比。同時(shí)，比較了三種提取檸檬苦素的影響因素：時(shí)間對(duì)檸檬苦素的提取影響最大，溫度其次，液料比影響最?。惶崛幟士嗨氐淖罴压に嚄l件為：提取時(shí)間4小時(shí)最佳，提取溫度70℃最佳，液料比在1g:80mL

42、最佳。</p><p><b>　　4 展望</b></p><p>　　檸檬苦素是橘子中主要的苦味成分，植物源食物如水果、蔬菜等，可以有效抵抗很多疾病的發(fā)生[13]。水果和蔬菜等植物中含有的大量檸檬苦素等生物活性物質(zhì)[14]，它們都能夠調(diào)節(jié)人體機(jī)能，預(yù)防癌癥和一些慢性疾病的發(fā)生。雖然現(xiàn)代的科學(xué)對(duì)檸檬苦素的生物活性有所研究，而且，取得的成果也相當(dāng)可觀，但是目前仍處于廣

43、泛實(shí)驗(yàn)階段，沒有進(jìn)行廣泛的應(yīng)用，原因或許因?yàn)槌杀靖?，設(shè)備要求也高，無法取得較好的經(jīng)濟(jì)效益。因此，研究出成本低，設(shè)備要求廣泛的提取途徑是很有必要的，展望未來，應(yīng)廣泛應(yīng)用檸檬苦素于各種社會(huì)行業(yè)，發(fā)揮其最大的使用價(jià)值，對(duì)以后的發(fā)展和研究提供有力的依據(jù)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] D BennettR,S Hasegawa.Z

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