橘籽中檸檬苦素的提取工藝研究【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　橘籽中檸檬苦素的提取工藝研究</p><p><b>　　專業(yè)：應用化學</b></p><p>　　摘要：本論文采用高效液相色譜法(HPLC)利用正交設

2、計實驗來確定橘籽中提取檸檬苦素的最佳工藝條件。結果顯示：最大限量提取檸檬苦素的最佳實驗條件是：反應溫度為70℃，提取時間為4小時，液料比為1g：80mL。關鍵詞：高效液相色譜法(HPLC)；橘籽；正交設計；檸檬苦素</p><p>　　The extraction process of limonin from orange seeds</p><p>　　Abstract: In th

3、is study, we used the orthogonal experimental design, using high performance liquid chromatography (HPLC) to determine some of the best conditions of extraction of Limonin briefly. Based on the experimental data, we can

4、obtain that the temperature of extraction can be controlled at around 70℃, the time can be controlled in 5 hours, and liquid ratio can be controlled in 1:80(g/mL).</p><p>　　Key words: high performance liquid

5、 chromatography (HPLC); orange seeds; limonin; orthogonal</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　1.1檸檬苦素的簡介1</p><p>　　1.2檸檬苦素的作用

6、1</p><p>　　1.2.1 檸檬苦素的抗癌作用1</p><p>　　1.2.2 檸檬苦素在柑桔化學分類上的作用2</p><p>　　1.3檸檬苦素的檢測方法2</p><p><b>　　2.實驗部分2</b></p><p>　　2.1 儀器與試劑2</p>

7、<p>　　2.1.1 實驗儀器2</p><p>　　2.1.2 實驗試劑3</p><p>　　2.2 實驗原理3</p><p>　　2.3 實驗步驟3</p><p>　　2.3.1 繪制檸檬苦素標準曲線3</p><p>　　2.3.2 設計正交實驗表3</p><p

8、>　　2.3.3 檸檬苦素的提取4</p><p>　　2.3.4 檸檬苦素的檢測4</p><p><b>　　3.結果與分析4</b></p><p>　　3.1 檸檬苦素標準品高效液相色譜圖5</p><p>　　3.2標準曲線圖的繪制5</p><p>　　3.3實驗樣品的

9、HPLC檢測6</p><p>　　3.4 數(shù)據處理12</p><p>　　3.5 結果分析14</p><p><b>　　4 展望14</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1 引言</b></p>&l

10、t;p>　　1.1檸檬苦素的簡介</p><p>　　檸檬苦素類化合物主要存在于蕓香科植物果實中，如枳實（臍橙、柑桔、香橙）柚等中。以果核（種子）中含量較高，果皮中含量較少（約萬分之一至十萬分之五）。柑桔中的類檸檬苦素存在兩種形式，一種為類檸檬苦素配基化合物，已分離鑒定出37種[1]，另一種為類檸檬苦素葡萄搪苷化合物，已分離鑒定出21種[2]。</p><p>　　檸檬苦素的分子式：

11、C26H30O8；分子結構如圖1-1所示：</p><p>　　圖1-1檸檬苦素的分子結構</p><p>　　最新研究表明柑橘中的三萜類物質在抗腫瘤方面有相當好的成效，檸檬苦素(1imonin)及其類似物就是其中一類重要組分[3]。檸檬苦素及其類似物在抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、改善睡眠、抗病毒、抗菌、利尿、抗焦慮，調節(jié)體內膽固醇含量、防止動脈粥樣硬化和除蟲等方面都具有顯著效果[4]。日本、美國

12、已報道了檸檬苦素類物質制作功能性食品和飲料的專利[5]，檸檬苦素的應用前景極為可觀。目前，檸檬苦素主要采用熱提取、浸泡提取及超臨界萃取等提取方法從天然植物中提取，研究人員已經成功從蕓香科和楝科的多種植物中提取出檸檬苦素及其類似物[6]。由于熱提取和浸泡提取檸檬苦素，需要耗費大量的時間和不必要的溶劑浪費，而且，在提取檸檬苦素的過程當中，脫脂和提取過程中所需要的溶劑對人體健康又有影響，而對于用超臨界萃取的提取方法來說，節(jié)省了時間與溶劑的用量

13、，并且無污染。然而，對于現(xiàn)階段的科技發(fā)展，超臨界萃取的方法，無法得到廣泛的應用。因此，對于如何在最有效的時間，用最合適的溶劑和溶劑用量及盡最大限度來控制提取過程中溶劑對人體健康的影響的研究，顯得越來越重要。</p><p>　　1.2檸檬苦素的作用</p><p>　　1.2.1 檸檬苦素的抗癌作用</p><p>　　1989年Lam[7]等用柑桔類檸檬苦素在小鼠

14、上做試驗，發(fā)現(xiàn)類檸檬苦素能誘導GST（谷胱甘肽轉移酶）的活性，能抑制化學致癌物誘導的腫瘤的發(fā)生。其中諾米林在肝臟和小腸粘膜的誘導性最高，檸堿的誘導作用較弱。檸堿和諾米林對BP誘導ICR4Ia小鼠前胃癌的抑制作用試驗，結果表明，諾米林劑量為10mg時，其腫瘤數(shù)量減少50%，諾米林抗癌效果優(yōu)于檸堿。Miller[8]等研究發(fā)現(xiàn)，口服檸堿(2.5%)的田鼠，可使DMBA誘導TPA促進的口腔癌腫瘤數(shù)量減少20%，重量減少50%。諾米林對DMBA

15、誘導的癌癥的抑制作用不如檸堿。他們還發(fā)現(xiàn)，檸堿在皮膚癌促進期的抑制作用優(yōu)于諾米林，而諾米林恰好相反，在起始階段抑制作用強。Miller[9]等發(fā)現(xiàn)葡萄糖苷有相同的化學抑制活性，對DMBA誘導的田鼠皮膚癌有抑制作用，檸堿葡萄糖苷3.5%濃度下表現(xiàn)出對動物平均腫瘤負擔下降55%，并且高于諾米林葡萄糖苷和諾米林酸葡萄糖苷，類檸檬苦素抗癌的機理還在進一步探討中，大多數(shù)研究人員認為與其結構中的吠喃環(huán)有很大關系。</p><p&

16、gt;　　1.2.2 檸檬苦素在柑桔化學分類上的作用</p><p>　　類檸檬苦素為柑桔次生代謝產物之一，特征性的類檸檬苦素及其生物合成途徑只在特定的種或屬中存在，每一栽培品種的類檸檬苦素含量模型是唯一的[10]。從柑桔植物的分布情況看，純種的柑桔亞屬由寬皮柑桔、袖和枸椽等3個原種與它們的雜交種構成(按照施文格分類法)。由于蕓香科金柑屬、宜昌橙、積屬植物與柑桔雜交，產生了許多雜交種。這些雜交種除含有檸堿群外，還

17、含有各自的特征化合物，通過分析這些化合物，可以推測出雜交種的親本，而且分析柑桔及其近緣植物的類檸檬苦素，對于評價己有分類系統(tǒng)及培育新的雜交種，篩選優(yōu)良柑桔和品種鑒定具有重要意義。</p><p>　　1.3檸檬苦素的檢測方法</p><p>　　經過多年的研究，檸檬苦素類化合物的分析方法仍存在許多技術問題。如缺少對檸檬苦素類化合物的快速定量的檢測方法及商業(yè)標準；該類化合物成分復雜，難以分離

18、；所以建立一種能夠有效分析該類物質的方法一直是科學工作者為之奮斗的目標。目前常用的方法有：</p><p>　?。?）薄層色譜法（TCL）</p><p>　　（2）分光光度法（UV）</p><p>　?。?）高效液相色譜法（HPLC）</p><p>　　其中HPLC方法因其良好的精密度、重現(xiàn)性和普遍性成為檸檬苦素類化合物最常用的分析方法

19、。Rouseff和Fisher[11]建立了正相高效液相色譜法，采用CN基鍵合硅膠柱和正己烷、異丙醇、甲醇的三元體系，有效分離奧巴叩酮、諾米林、檸檬苦素和脫氧諾米林等4種苷元。Hasegawa和Manners[12]使用微球硅膠柱和環(huán)己烷、四氫吠喃的二元體系分離檸檬苦素類化合物苷元，該方法的高選擇性已經達到商業(yè)標準。</p><p>　　本實驗的研究選擇了利用高效液相色譜法進行高精密度的檢測，來確定提取檸檬苦素的

20、各方面的工藝參數(shù)，從而為檸檬苦素的研究發(fā)展提供有力的依據。</p><p><b>　　2.實驗部分</b></p><p><b>　　2.1 儀器與試劑</b></p><p>　　2.1.1 實驗儀器</p><p>　　島津LC-20AT型高效液相色譜儀、SH2-D3型予華牌循環(huán)水蒸空泵（鞏

21、義市予華儀器有限公司）、85-1水浴磁力攪拌器 (杭州儀表電機有限公司)、RE301(3L)旋轉蒸發(fā)器 (河南一恒儀器有限公司)</p><p>　　2.1.2 實驗試劑</p><p>　　所用實驗試劑如表2-1表示：</p><p><b>　　表2-1 實驗試劑</b></p><p><b>　　2.2

22、 實驗原理</b></p><p>　　本實驗以橘籽為原料，將其曬干，研磨成粉末用石油醚（60℃～90℃）進行脫脂，烘干。再將脫脂后烘干的橘子粉末用丙酮作為提取液在水浴磁力攪拌器中進行提取，將提取液通過HPLC判斷檸檬苦素的含量，以確定提取檸檬苦素的最佳工藝流程。</p><p><b>　　2.3 實驗步驟</b></p><p>

23、;　　2.3.1 繪制檸檬苦素標準曲線</p><p>　　精密稱取檸檬苦素標準品0.0010g，用丙酮作為溶劑，分別制取8種不同濃度的檸檬苦素溶液，標記為1、2、3、4、5、6、7、8。精密量取10μL的8種溶液分別注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程。</p><p>　　2.3.2 設計正交實驗表</p>&

24、lt;p>　　采用正交試驗設計，做出正交試驗表，本試驗選擇L16(43)正交表，具體實施方案詳見表2-2。</p><p>　　表2-2 正交設計實驗計劃表</p><p>　　2.3.3 檸檬苦素的提取</p><p>　?。?）取適量橘籽，將其研磨成粉末，稱取一定量的桔籽粉末，加入適量石油醚，在恒溫水浴鍋內進行脫脂：溫度70℃左右，時間在3～５小時之間。再

25、將脫脂后的桔籽粉末混合溶液進行抽慮，剩下脫脂后的桔籽粉末，再放置于烘箱進行烘干，溫度不宜太高，較室溫高一點就行。</p><p>　?。?）準確稱取16份質量均為1g的脫脂后的桔籽粉末，標記。</p><p>　?。?）按正交設計中的要求加入定量的丙酮，在磁力水浴攪拌器中進行水浴加熱提取。</p><p>　?。?）將加熱后的溶液冷卻，再通過旋轉蒸發(fā)儀進行旋蒸，將部

26、分丙酮蒸發(fā)，以取得較精確的實驗數(shù)據。</p><p>　　2.3.4 檸檬苦素的檢測</p><p>　　首先確定色譜條件：用體積比為45:55的乙腈-水做為流動相，流速為1mL/min，柱溫為常溫，檢測波長為210nm。將16份已標記的實驗樣品，各提取10μL，注入高效液相色譜儀，以標準檸檬苦素樣品為指標進行HPLC測定。</p><p><b>　　3

27、.結果與分析</b></p><p>　　3.1 檸檬苦素標準品高效液相色譜圖 </p><p>　　從圖3-1可知，標準樣品中檸檬苦素的保留時間為9.692min。</p><p>　　圖3-1 檸檬苦素標準品色譜圖</p><p>　　通過對不同溶度的標準檸檬苦素溶液樣品進行進樣，得到如表3-1所示的檸檬苦素濃度與峰面積間的對

28、應關系。</p><p>　　表3-1 標準樣品中檸檬苦素濃度與峰面積間的相應值</p><p>　　3.2標準曲線圖的繪制</p><p>　　通過標準樣品中檸檬苦素的度與峰面積之間的對應關系如表3-1，根據峰面積(Y)對其質量濃度(X, mg/L)回歸分析。得到圖3-2所示的檸檬苦素的標準曲線示意圖。其中，橫坐標是檸檬苦素的濃度，縱坐標為峰面積。</p&g

29、t;<p>　　圖3-2 檸檬苦素的標準曲線</p><p>　　由圖3-2可知，檸檬苦素峰面積Y間滿足關系式：Y=8524.3X+7359.7；方程的相關系數(shù)R2=0.9996；二者間線性關系良好。</p><p>　　3.3實驗樣品的HPLC檢測</p><p>　　通過保留時間對樣品中所含檸檬苦素進行定性，每個樣品平均進樣3次，所測保留時間在9.

30、69min左右。通過樣品中的檸檬苦素的峰面積和濃度之間的關系式：Y=8524.3X+7359.7；定量測定檸檬苦素的含量。</p><p>　　在60℃；丙酮用量40mL；水浴3h時，檸檬苦素的峰面積為979663，出峰時間在9.682min，如圖3-3所示：</p><p>　　圖3-3檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在60℃；丙酮用量60mL；水浴

31、4h時，檸檬苦素的峰面積為861509，出峰時間在9.663min，如圖3-4所示：</p><p>　　圖3-4檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在60℃；丙酮用量80mL；水浴5h時，檸檬苦素的峰面積為553209，出峰時間在9.683min，如圖3-5所示：</p><p>　　圖3-5檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p&g

32、t;　　在60℃；丙酮用量100mL；水浴6h時，檸檬苦素的峰面積為499709，出峰時間在9.686min，如圖3-6所示：</p><p>　　圖3-6檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在65℃；丙酮用量40mL；水浴4h時，檸檬苦素的峰面積為,584906，出峰時間在9.665min，如圖3-7：</p><p>　　圖3-7檸檬苦素的高效液相色譜

33、圖</p><p>　　在65℃；丙酮用量60mL；水浴3h時，檸檬苦素的峰面積為,1107416，出峰時間9.684min，如:3-8所示：</p><p>　　圖3-8檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在65℃；丙酮用量80mL；水浴6h時，檸檬苦素的峰面積為694156，出峰時間在9.627min，如圖3-9所示：</p><p

34、>　　圖3-9檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在65℃；丙酮用量100mL；水浴5h時，檸檬苦素的峰面積為640698，出峰時間在9.667min，如圖3-10所示：</p><p>　　圖3-10檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在70℃；丙酮用量40mL；水浴5h時，檸檬苦素的峰面積為840945，出峰時間在9.693min，如圖

35、3-11所示：</p><p>　　圖3-11檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在70℃；丙酮用量60mL；水浴6h時，檸檬苦素的峰面積為527990，出峰時間在9.667min，如圖3-12所示：</p><p>　　圖3-12檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在70℃；丙酮用量80mL；水浴3h時，檸檬苦素的峰面積

36、為914759，出峰時間在9.699min，如圖3-13所示：</p><p>　　圖3-13檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在70℃；丙酮用量100mL；水浴4h時，檸檬苦素的峰面積為441652，出峰時間在9.698min，如圖3-14所示：</p><p>　　圖3-14檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在75

37、℃；丙酮用量40mL；水浴4h時，檸檬苦素的峰面積為618746，出峰時間在9.701min，如圖3-15所示：</p><p>　　圖3-15檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在75℃；丙酮用量60mL；水浴3h時，檸檬苦素的峰面積為2523889，出峰時間在9.656min，如圖3-16所示：</p><p>　　圖3-16檸檬苦素的高效液相色譜圖&

38、lt;/p><p>　　在75℃；丙酮用量80mL；水浴4h時，檸檬苦素的峰面積為784514，出峰時間在9.636min，如圖3-17所示：</p><p>　　圖3-17檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p>　　在75℃；丙酮用量100mL；水浴5h時，檸檬苦素的峰面積為1400850，出峰時間在9.628min，如圖3-18所示：</p><

39、;p>　　圖3-18檸檬苦素的高效液相色譜圖</p><p><b>　　3.4 數(shù)據處理</b></p><p>　　經過高效液相色譜儀（HPLC）檢測，得出各組分樣品的峰面積，通過標準曲線回歸方程（Y=8524.3X+7359.7）計算出檸檬苦素的濃度，根據m=c*V，得出樣品中所含檸檬苦素的質量。列表如下：</p><p>　　表3

40、-2 峰面積與質量的對應列表</p><p>　　通過檢測出來的峰面積，根據檸檬苦素的標準曲線圖得出相應的濃度。同時測出所要檢測樣品的體積，測出樣品中所含檸檬苦素的質量：</p><p>　　表3-3 正交設計表</p><p><b>　　3.5 結果分析</b></p><p>　　根據參考文獻，選取了最有對比性的影

41、響因素以及各影響因素的水平范圍，經過一系列實驗，得出各組分數(shù)據，最后利用正交設計進行實驗數(shù)據處理，選擇最佳提取工藝，并與文獻中的方法以及它的工藝作對比，我們發(fā)現(xiàn)，通過正交得到的最佳條件，縮短了最佳提取時間，降低了最佳提取溫度范圍，調整了最佳提取液料比。同時，比較了三種提取檸檬苦素的影響因素：時間對檸檬苦素的提取影響最大，溫度其次，液料比影響最??；提取檸檬苦素的最佳工藝條件為：提取時間4小時最佳，提取溫度70℃最佳，液料比在1g:80mL

42、最佳。</p><p><b>　　4 展望</b></p><p>　　檸檬苦素是橘子中主要的苦味成分，植物源食物如水果、蔬菜等，可以有效抵抗很多疾病的發(fā)生[13]。水果和蔬菜等植物中含有的大量檸檬苦素等生物活性物質[14]，它們都能夠調節(jié)人體機能，預防癌癥和一些慢性疾病的發(fā)生。雖然現(xiàn)代的科學對檸檬苦素的生物活性有所研究，而且，取得的成果也相當可觀，但是目前仍處于廣

43、泛實驗階段，沒有進行廣泛的應用，原因或許因為成本高，設備要求也高，無法取得較好的經濟效益。因此，研究出成本低，設備要求廣泛的提取途徑是很有必要的，展望未來，應廣泛應用檸檬苦素于各種社會行業(yè)，發(fā)揮其最大的使用價值，對以后的發(fā)展和研究提供有力的依據。</p><p><b>　　參考文獻：</b></p><p>　　[1] D BennettR,S Hasegawa.Z

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