一種抗煙嘧磺隆基因的活性域研究.pdf

1、煙嘧磺隆(Nicosulfuron)是一種高效、廣譜的乙酰乳酸合成酶(Acetolactatesynthetase，ALS)抑制劑類除草劑。易被植物的根、葉吸收，在木質(zhì)部和韌皮部傳導(dǎo)，阻斷植物體內(nèi)支鏈氨基酸:纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸合成，從而導(dǎo)致植物死亡。由于其除草效果突出、可混性強(qiáng)、用量低、對(duì)人畜低毒等優(yōu)點(diǎn)而廣受歡迎。
　　 細(xì)胞色素P450家族(Cytochrome P450 super family, CYP)是一類廣泛存

2、在于動(dòng)植物及微生物體內(nèi)的血紅素氧化酶系。能增強(qiáng)異源物質(zhì)的水溶性，使它們更易排出體外。該功能在除草劑解毒方面有重要意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)室從玉米(Zea mays)基因組中獲得了兩個(gè)細(xì)胞色素P450基因，253基因和513基因，分別編碼2個(gè)氨基酸序列相似度高達(dá)86.1％細(xì)胞色素P450蛋白。253基因所編碼的蛋白質(zhì)具有良好的煙嘧磺隆抗性，而513基因編碼的蛋白質(zhì)不具備相應(yīng)抗性。兩個(gè)同源蛋白相應(yīng)功能的差別為我們研究253基因功能區(qū)域提

3、供了有利條件。本研究以253基因不同區(qū)域替換513基因相應(yīng)的部位，產(chǎn)生7個(gè)雜交基因。通過對(duì)這7個(gè)雜交基因的煙嘧磺隆抗性研究，初步判定253基因的活性區(qū)域。水稻(Oryza sativa)作為全球重要糧食作物，其轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究較為深入，轉(zhuǎn)化條件成熟;另外，水稻本身不具備煙嘧磺隆抗性，因此我們選擇水稻為基因受體。通過農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，以潮霉素(Hygromycin)作為篩選標(biāo)記，獲得

4、分別含有不同雜交分子的轉(zhuǎn)基因水稻株系。
　　 煙嘧磺隆抗性分析結(jié)果顯示，在生根階段含有煙嘧磺隆(0.1mg/L)的培養(yǎng)條件下和水培階段正常使用濃度(80mg/L)噴施條件下，雜交分子含有253基因第282至597bpDNA序列的轉(zhuǎn)基因水稻株系均生長(zhǎng)良好，未表現(xiàn)出藥害，其它基因的轉(zhuǎn)化株系均枯萎死亡。由此推斷，253基因編碼的蛋白氨基酸序列中，第94至199個(gè)氨基酸組成的多肽片段對(duì)其表現(xiàn)煙嘧磺隆抗性有重要作用。
　　 明確2