擬南芥CSN1對(duì)COP1細(xì)胞內(nèi)定位的影響以及CSN1生物學(xué)功能的進(jìn)一步探討.pdf

1、I盟些叢盥塋也韭L』城亟垡恥捌旦韭地蚶出生縫唑鞋盥娶垡址土盟芏=盥蛐螬—?jiǎng)h目錄摘第一章綜述～7第一節(jié)CSN復(fù)合體概進(jìn)7凹、CSN復(fù)合體的發(fā)現(xiàn)7CSN復(fù)合體的結(jié)構(gòu)11i成和分布8CSN復(fù)弁體的生化活性9CSN復(fù)臺(tái)體與泛錄／26S蚩閂酶體臍解途徑J0泛索／26S蛋口酶體降解途徑簡(jiǎn)介10(二)26S蛋白脯體12(三)CSN復(fù)合體與26S蛋白酶體的關(guān)系13(四)CSN復(fù)臺(tái)體與泛桑／26S蛋臼酶體降解途徑的關(guān)系14五、CSN復(fù)合體的細(xì)胞功能15C

2、SN復(fù)合體和細(xì)胞捌期～15CSN復(fù)合體和摹兇表達(dá)16(三)CSN復(fù)合體和DNA修復(fù)1A、CSN復(fù)合體在植物生長(zhǎng)發(fā)育葉]的重要作用178七、CSN復(fù)合體LlCSNI的功能19幫二節(jié)植物光信號(hào)傳遞選釋研究進(jìn)展。21、概述一2l_二、COP／DEF／FUS蛋白研究進(jìn)展21三、COPI結(jié)構(gòu)、分布和功能段研究進(jìn)展22第二節(jié)研究?jī)?nèi)容和意義24第二章CSNl對(duì)COPI細(xì)胞山定位的影響25引言。25第一竹材料與方法25一、材料25一、方法26(一)質(zhì)粒

3、的構(gòu)建及箍定26(二)基凼槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮蜘胞，29(一)酵母雙雜交分析實(shí)驗(yàn)32(四)擬南芥萌發(fā)、雜交與GUS染色36五)原核表達(dá)體系操作及PulI—down實(shí)驗(yàn)37第二：符結(jié)果與分析一、洋慧表皮細(xì)胞中擬南撲CSN復(fù)合體的業(yè)基對(duì)COPI40業(yè)細(xì)胞定位帕影響盟生堅(jiān)赴世羔韭監(jiān)上j虹恥Ⅱ羔盟型旦韭地必岫丘世咀鞋咀盔垡盟d_塹噬坳監(jiān)蛆韭—必摘要?jiǎng)hY22㈣27㈣595cl】P9信號(hào)復(fù)合體(CSN)是一個(gè)保守的蛋白復(fù)合件由8個(gè)下硎的皿_Ii組成依次

4、命名為CSNICSN8。CSN復(fù)合體最初足在對(duì)擬南莽光形態(tài)發(fā)生的遺傳學(xué)研究tJ被發(fā)現(xiàn)的，r被變體幼苗都呈現(xiàn)組成型光形態(tài)建成的表型。CSN、COPI以及COPIO—DDBl一DETI(CDD)復(fù)合體都是調(diào)節(jié)植物光反應(yīng)和發(fā)育的關(guān)鍵因子。COPl受到光信號(hào)影響會(huì)改變其在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)巾的丹布比例，早期擬南芥遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)COPI的細(xì)胞核定位需要CSN復(fù)合體的存在但CSN復(fù)合體影響COPI的細(xì)胞內(nèi)定位的分子機(jī)制還沒(méi)有報(bào)道。為了探討COPI在細(xì)胞

5、內(nèi)定位的分子機(jī)制利用洋蔥表皮細(xì)胞瞬間表達(dá)系統(tǒng)，我們發(fā)現(xiàn)批表達(dá)的CSNI能夠促進(jìn)GUS—COPI的細(xì)胞核定位，且CSNI的N一術(shù)端是促進(jìn)GUSCOPl細(xì)胞核定位的關(guān)鍵。同時(shí)利用擬卣井csn／突變體，證實(shí)CSNi的N一末端是COPl實(shí)現(xiàn)細(xì)胞核定位不可缺少的蛋白片段。進(jìn)而利用酵母積雜交系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CSNl通過(guò)其N(xiāo)一末端結(jié)構(gòu)域直接和COPl的coiledcoiI結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用并且通過(guò)免疫jt沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)COPl乖lCSN復(fù)合體在擬南芥體內(nèi)存

6、在豐f『互作j目。此外tCSNIxj『coPl細(xì)胞棱定位的促進(jìn)作用需要COPl自身細(xì)胞核定位信號(hào)的參與，同時(shí)也與COP|的coiledcoll結(jié)構(gòu)域有關(guān)。COPI的coiled—coil結(jié)構(gòu)域不僅是CSNI的結(jié)合區(qū)。還包含了coPl細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)的一部分。這些發(fā)現(xiàn)使我(flCSN復(fù)臺(tái)體影響COPl的細(xì)胞定位的機(jī)制有了進(jìn)一步的了解為々后深入研究CSN復(fù)臺(tái)體調(diào)控植物光形態(tài)發(fā)生的分予機(jī)制提供了一定的儆據(jù)。CSN復(fù)合體最初被定義為擬南芥光形態(tài)發(fā)

7、生的抑制因子，隨著研究的深入人們發(fā)￡ECSN復(fù)合體參與真核生物的各種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程以及細(xì)胞周期等細(xì)胞變化進(jìn)程。CSNI業(yè)基的卜末端包含一個(gè)PCI結(jié)構(gòu)域該結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白業(yè)基與亞基的相互作jij以及CSN復(fù)臺(tái)體的形成。CSNl的N一末端小參與CSN復(fù)合體的彤成，但是對(duì)CSN復(fù)合體的功能起著重要作刷，為了深入r解CSN復(fù)合體如何通過(guò)CSNl調(diào)控植物的生K發(fā)育等過(guò)程奉研究利用酵母取雜交文庫(kù)篩選技術(shù)尋找CSNl的卜未端相互作用蛋白扶得了5個(gè)候選蛋白

8、分別是PAD2、TSAl、elF_2家族蛋白、核糖體60s業(yè)基蛋E3L35以及個(gè)含c2結(jié)構(gòu)域的蛋向，州對(duì)其中的PAD2、TSAI的相關(guān)功能進(jìn)行了初步研究。PAD2是26S蛋白酶體的棱心組分20S蛋白酶體n勺Ⅱ亞基之一。已有證據(jù)揭示擬南芥中CSN復(fù)合體、26S蛋白酶體和SCF型黜連接酶能夠相互站臺(tái)形成更大的復(fù)臺(tái)體而日擬南芥SCF型E3可以通過(guò)Skpl亞基SnRK一蛋白激酶的直接相互作用錨定到PADl上。但日前關(guān)于CSN復(fù)合體通過(guò)何種方式參