新型肽類BACE1抑制劑的設(shè)計、合成及活性研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)又稱老年癡呆癥,是老年人由于腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能障礙綜合癥。目前臨床用藥主要為乙酰膽堿酯酶抑制劑等暫時改善認(rèn)知癥狀的藥物,不能從根本上治愈AD。
　　由于AD的致病機(jī)制復(fù)雜,對其尚無全面徹底的認(rèn)識,出現(xiàn)了多種假說解釋其病因。其中,淀粉樣蛋白學(xué)說越來越受到普遍接受。該學(xué)說認(rèn)為,β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptides, Aβ)聚集形成老年斑,在AD的病理

2、發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。Aβ是β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)先后經(jīng)β、γ-分泌酶水解的產(chǎn)物。處于上游的β-分泌酶是治療AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。β-分泌酶包括BACE1(βamyloid cleaving enzyme1, Asp2, memapsin2)和BACE2(βamyloid cleaving enzyme2, Asp1, memapsin1)。抑制BACE1是防治AD的重要途徑。<

3、br>　　目前,越來越多的BACE1抑制劑表現(xiàn)出良好的生物活性和應(yīng)用前景,但受多種因素影響,僅有一個BACE1抑制劑(CTS-21166)成功完成了Ⅱ期臨床研究。已經(jīng)報道的BACE1抑制劑主要包括肽(或擬肽)類、非肽類兩大類。從天然產(chǎn)物及BACE1的代謝途徑尋找BACE1抑制劑也倍受關(guān)注。
　　本研究分別從BACE1的作用機(jī)制、代謝途徑及天然產(chǎn)物出發(fā),合成了三個先導(dǎo)化合物,并設(shè)計合成了三類、共計56個目標(biāo)化合物。以EGCG為陽性對

4、照,應(yīng)用時間分辨熒光法測定目標(biāo)化合物體外對BACE1的抑制作用,并對其構(gòu)效關(guān)系分別進(jìn)行了討論。
　　BACE1屬于天冬氨酰蛋白酶家族,該家族酶的作用機(jī)制是其催化中心兩個Asp的β羧基側(cè)鏈與底物相互作用,經(jīng)過四面體過渡中間態(tài),使底物酶切位點(diǎn)的肽鍵水解斷裂?；谠摍C(jī)制,在底物被酶切位點(diǎn)引入過渡中間態(tài)的模擬物以構(gòu)建化合物,是設(shè)計BACE1抑制劑的一個重要方式。里程碑式的肽類BACE1抑制劑K MI-008也是基于這一方式得到。其在底物的

5、酶切位點(diǎn)(P1位)引入的四面體中間態(tài)模擬結(jié)構(gòu)單元為Pns[Phenylnorstatine,(2R,3S)-3-amino-2-hydroxy-4-phenylbuty-ric acid]。Pns的2位羥基、羧基形成的酰胺基與酶催化中心的Asp32、Asp228相互作用,構(gòu)成了多個環(huán)狀結(jié)構(gòu);Pns的苯環(huán)與酶S1口袋存在疏水作用,除Pns以外的其它部分與酶的各口袋也都有較好結(jié)合。提示羥基等富電子功能基,芳香環(huán)及環(huán)狀結(jié)構(gòu)在功能區(qū)的核心結(jié)構(gòu)中

6、起重要作用。本課題合成了KMI-008,并以其為先導(dǎo)化合物,基于天冬氨酰蛋白酶家族催化裂解機(jī)制,分別或同時引入羥基等富電子功能基團(tuán)、芳香基及吡咯環(huán)等基團(tuán)代替先導(dǎo)化合物的核心結(jié)構(gòu) Pns,設(shè)計合成了K系列共38個肽序列。通過對其進(jìn)行體外活性評價,有10個目標(biāo)化合物對B ACE1的抑制作用較強(qiáng);其中,LK-MX-K1059、LK-MX-K1091及LK-MX-K1093的抑制作用與先導(dǎo)化合物KMI-008相當(dāng)。對于K系列化合物,單獨(dú)引入羥基

7、等富電子功能基、吡咯環(huán)或D-芳香基,都不能得到活性較好的目標(biāo)肽;但單獨(dú)引入取代的L-芳香基,更換芳香環(huán)上的取代基(尤其是引入4-Cl-Phe的目標(biāo)肽LK-MX-K1093),抑制作用提高;同時引入L-Phe和D-Pro(LK-MX-K1059),抑制作用與先導(dǎo)化合物KMI-008相當(dāng);在吡咯環(huán)的4位引入羥基、氨基等富電子功能基,不能進(jìn)一步提高目標(biāo)肽的抑制作用;含有L-Phe-D-Pro結(jié)構(gòu)的肽序列,可能成為新型肽類BACE1抑制劑的先導(dǎo)

8、化合物。去除其C端的三個氨基酸,得到的五肽仍能保持其大部分抑制作用。
　　應(yīng)用Autodock4對所合成的K系列目標(biāo)化合物與BACE1進(jìn)行了分子對接,同先導(dǎo)化合物KMI-008進(jìn)行比對,進(jìn)一步分析其構(gòu)效關(guān)系。對BACE1有一定抑制作用的目標(biāo)化合物與先導(dǎo)化合物KMI-008均有一定的相似度,并具有較低的結(jié)合能。引入L-Phe-D-Pro的LK-MX-K1059與引入L-Phe-(cis,D)-Hyp的LK-MX-K1091中,D-P

9、ro使肽主鏈發(fā)生了部分扭轉(zhuǎn);Pns的羥基處于吡咯環(huán)氨基形成的酰胺基與5位CH2共同構(gòu)成的空間中;苯丙氨酸的苯環(huán)與Pns中的苯環(huán)位置相近,位于相同的口袋。L-Phe-D-Pro共同模擬了Pns的作用,即模擬了BACE1與底物相互作用的四面體過渡態(tài);含有該結(jié)構(gòu)的肽序列有可能成為研究新型肽類BACE1抑制劑的另一途徑。Hyp的4位羥基處于酶相對松散的空間中,使兩目標(biāo)化合物的抑制作用沒有差別。只引入L-型取代芳香丙氨酸或L(D)-4-取代的Pr

10、o,其環(huán)狀結(jié)構(gòu)與Pns中的苯環(huán)位置接近。在Phe的苯環(huán)上引入不同的取代基,其與酶的相互作用關(guān)系在對接結(jié)果中沒有顯著差別,還需另行研究。引入D型芳香丙氨酸后,整個肽鏈發(fā)生扭轉(zhuǎn),酶中的多個空穴都未得到適當(dāng)填充。配體C端基本位于BACE1結(jié)合口袋外部,與BACE1各活性位點(diǎn)距離較遠(yuǎn),相互作用較小。說明該類化合物的C末端對其活性影響作用較小。
　　膜蛋白RTN3(Reticulons3)是BACE1的輔助因子(Binding partne

11、r),通過阻斷BACE1與底物的結(jié)合,可劑量依賴地降低BACE1活性并顯著減少Aβ,同時并不影響B(tài)ACE2及γ分泌酶的作用。有研究顯示,RTN3的C端第31至36個氨基酸所組成的肽段(Tyr-Lys-Thr-Gln-Ile-Asp)是與BACE1結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域(Binding Domain,BD)。RTN3的部分肽片段很有可能成為無毒、高特異性的新型BACE1抑制劑的先導(dǎo)物。本課題截取RTN3中含有或不含BD的肽段,設(shè)計合成了10條肽序

12、列。通過活性評價,含有與不含BD的目標(biāo)肽,對BACE1都有一定的抑制作用,說明對BACE1的抑制作用很可能取決于與BD相鄰的肽段,其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。該類目標(biāo)化合物對BACE1的抑制作用遠(yuǎn)低于已經(jīng)報道的肽類BACE1抑制劑,不宜做為BACE1抑制劑的先導(dǎo)化合物。
　　有報道稱,啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae提取物S.cerevisiae K-7、植物插田泡(Rubus coreanus)中提取物R

13、c分別為8肽(Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ile-Gly-Se r)、4肽(Gly-Trp-Trp-Glu),它們對BACE1具有抑制作用。本課題合成了S.cerev-isiae K-7及Rc,并以S.cerevisiae K-7為先導(dǎo)化合物,對其進(jìn)行了丙氨酸替換及C末端氨基酸剪切,合成了8條肽序列。通過體外活性評價,該系列目標(biāo)化合物對BACE1幾乎都沒有抑制作用,與文獻(xiàn)報道不同。
　　所有目標(biāo)肽均經(jīng)固相法、采用Boc