DNA免疫制備豬傳染性胃腸炎病毒S基因單克隆抗體和特性分析.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Porcine transmissible gastroenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的以腹瀉、嘔吐、脫水等為主要癥狀的高度接觸性、消化道傳染病。該病感染仔豬的致死率能達(dá)到100％，TGE的爆發(fā)和流行給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 本研究將豬傳染性胃腸炎病毒上帶有A、B、C、D四個(gè)抗原位點(diǎn)的S基因克隆到

2、真核表達(dá)載體PVAX中，構(gòu)建的重組真核表達(dá)質(zhì)粒PVAX-TGEV-S免疫BALB/c小鼠，在免疫后的42天，建立間接ELISA的檢測(cè)方法，即:以TGEV全病毒包被ELISA板，5％的脫脂乳作為封閉劑，一抗、二抗的作用時(shí)間均為60min，檢測(cè)到小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較高的抗體水平。因此，我們按照常規(guī)方法進(jìn)行了細(xì)胞的融合。以TGEV上清液為篩選抗原，用建立的間接ELISA方法進(jìn)行篩選，采用有限稀釋法，經(jīng)過(guò)三次克隆，最終獲得兩株雜交瘤細(xì)胞(分別命名為1

3、H4，4E9)。兩株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體亞類都為IgM類，間接免疫熒光試驗(yàn)中，兩株單抗均能與TGEV的上清液反應(yīng)，能觀察到細(xì)胞膜表面有特異性的亮綠色熒光，而在SP2/0對(duì)照組中，未見(jiàn)到有亮綠色熒光的產(chǎn)生。通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)，1H4單抗可以識(shí)別TGEV全病毒的S蛋白(220KD)的線性表位。
　　 以豬傳染性胃腸炎(TGEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)為抗原，分別與兩株

4、雜交瘤細(xì)胞上清液作用，經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明兩株單抗與TGEV有特異性反應(yīng)，而與PRRSV、PEDV不存在交叉反應(yīng)，說(shuō)明獲得的單抗有良好的特異性。以不同稀釋度純化的TGEV為抗原，應(yīng)用Dot-ELISA方法檢測(cè)了病毒與兩株單抗的反應(yīng)性，結(jié)果表明兩株單抗都能與TGEV反應(yīng)并出現(xiàn)深色的印記，最低檢出率為0.005μg/點(diǎn)，而與SP2/0細(xì)胞上清沒(méi)有反應(yīng)性。
　　 同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)利用蝕斑技術(shù)證明了1H4單抗在病毒中和活性實(shí)驗(yàn)中具

5、有一定的中和病毒的活性，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。
　　 將單克隆抗體作為檢測(cè)TGEV的試劑，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)病毒，根據(jù)間接ELISA的陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，確定抑制率大于10.77％的情況下即為陽(yáng)性。該檢測(cè)方法與TGEV、PRV和PEDV無(wú)交叉反應(yīng)，與RT-PCR檢測(cè)病毒的方法相比其符合率為94.11％，并且多次重復(fù)性試驗(yàn)穩(wěn)定性較好。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的建立不但在生產(chǎn)上提供了一種更簡(jiǎn)單、快速、靈敏及應(yīng)用廣泛的TGEV檢測(cè)